In vitro Modelo de vaso humano fetal en chip para estudiar la mecanobiología del desarrollo

NOTA: Todas las técnicas de cultivo celular deben realizarse en condiciones estériles en una campana de flujo laminar y las células deben incubarse a 37 °C en una atmósfera humificada con 5% de CO2. Las instrucciones para toda la preparación de citocinas tanto para el mantenimiento (rhbFGF) como para el protocolo de diferenciación (rhBMP4, rhVEGF, rhbFGF, rhIL6, rhFLT3L, rhIGF1, rhIL11, rhSCF, rhEPO, rhTPO, rhIL3) se encuentran en la Tabla Suplementaria S1. 1. Cultivo de hiPSCs: descongelación, mantenimiento y congelación de células Preparación de medios de mantenimiento, factores de crecimiento y otros reactivosPrepare el medio de cultivo añadiendo el suplemento de medio libre de suero de hESCs entero, 36 mL de 25% de albúmina sérica bovina (BSA) y 1 mL de 55 mM de β-mercaptoetanol al medio basal Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F-12) de Dulbecco (ver Tabla de Materiales). Resuspender 1 mg de inhibidor de la Rho quinasa (iRock) en 1 mL de DMSO, hacer alícuotas de 50 μL y almacenarlas a -20 °C.NOTA: Estas alícuotas pueden mantenerse a -20 °C durante 1 año. Una vez descongelados, se pueden mantener a 4 °C durante 1 semana. Descongelar la solución de vitronectina (VTN-N) en hielo y alícuota 60 μL por vial antes de almacenarla a -80 °C. Justo antes de recubrir las placas, diluir el caldo de 60 μL en 6 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco; la concentración final de 5 μg/mL. Descongelación de líneas celulares hiPSCNOTA: La línea de células madre pluripotentes humanas SFCi55 se derivó previamente internamente y se utilizó ampliamente para la diferenciación en varios tipos de células y diferentes linajes embrionarios 19,20,21,22.Cubrir un pocillo de una placa de 6 pocillos con 1 ml de solución de VTN-N durante 1 h a 37 °C.NOTA: Después de la incubación, las placas recubiertas pueden almacenarse a 4 °C durante un máximo de 1 semana. Aspirar la solución de VTN-N con una pipeta de aspiración y añadir 1 mL de medio de cultivo precalentado suplementado con 20 ng/mL de rhbFGF (Tabla suplementaria S1). Descongele rápidamente el vial que contiene las hiPSC en un baño de agua y transfiera la célula a 5 ml de medio de cultivo precalentado. Girar las celdas hacia abajo durante 3 minutos a 300 × g a temperatura ambiente. Resuspender el gránulo celular en 0,5 mL de medio de cultivo suplementado con 20 ng/mL de rhbFGF. Transfiera las células a un pocillo recubierto que contenga ya 1 ml de medio. Añadir 5 μL de iRock en los pocillos que contienen las células en un total de 1,5 mL de medio. Cultive las células en la incubadora, cambie el medio diariamente durante la semana y alimente dos veces las células, agregando el doble del volumen normal de medio a las células para garantizar la alimentación durante el fin de semana.NOTA: Las células se cultivan en presencia de iRock solo durante 24 h. Mantenimiento y paso de hiPSCsCambie el medio diariamente con medio de cultivo fresco precalentado suplementado con 20 ng/ml de rhbFGF. Pasar las células cuando alcancen aproximadamente el 80% de confluencia, generalmente dos veces por semana.Para pasar las células, recubra una placa con VTN-N como se describió anteriormente en los pasos 1.2.1 y 1.2.2. Aspire el medio de los pocillos con celdas y lávelos con DPBS. Aspirar el DPBS y añadir 1 mL de reactivo de disociación (ver Tabla de Materiales) e incubar durante 1 min. Aspirar el reactivo de disociación e incubar durante 3 minutos más. Golpee firmemente el plato 10 veces en cada lado.NOTA: El paso de disociación puede necesitar una optimización específica del tipo de célula en el tiempo de incubación y el procedimiento de roscado. Añadir 1 mL de medio de cultivo a las células y con una pipeta Pasteur, lavar una vez con el medio para asegurar que se recogen la mayor parte de las colonias. Agregue 150 μL de la suspensión celular a cada pocillo para proporcionar una relación de paso de 1 pocillo a 6.NOTA: Inmediatamente después de descongelar un nuevo vial, es mejor pasar las células en una proporción más baja, como 1:1 o 1:2 durante uno o dos pases para permitirles alcanzar una fase de crecimiento constante antes de pasar a una proporción de 1:6. Cultive las células en la incubadora, cambie el medio diariamente durante la semana y alimente dos veces las células una vez durante el fin de semana. Congelación de líneas celulares hiPSCsNOTA: Congele las células dentro de sus dos primeros pasos después de la descongelación para asegurarse de mantener un lote constante de viales congelados de bajo paso para comenzar el cultivo. Congelar las células cuando alcancen una confluencia de aproximadamente el 80%.Cambie el medio por medio de cultivo fresco precalentado suplementado con 20 ng/ml de rhbFGF y 5 μl de iRock e incube durante al menos 1 h. Separe las celdas como se describe en los pasos 1.3.2.2-1.3.2.5. Recoja las células desprendidas en un tubo de centrífuga de 15 ml que contenga 5 ml de medio de cultivo. Centrifugar durante 3 min a 300 × g a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y añadir 1 mL de solución de criopreservación (ver Tabla de Materiales). Con una pipeta Pasteur, pipetee suavemente las células hacia arriba y hacia abajo para mezclarlas en la solución de criopreservación.NOTA: Evite el pipeteo excesivo, que podría dar lugar a la disociación de los grupos de células. Divida la suspensión celular en dos viales de criopreservación de 0,5 ml cada uno. Transfiera los viales de criopreservación a un recipiente de criopreservación preenfriado a 4 °C. Transfiera el recipiente con las celdas a un congelador a -80 °C durante 24 h antes de transferir los viales a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. 2. Diferenciación de las hiPSCs en células endoteliales Preparación del medio de diferenciación, citocinas y factores de crecimientoPreparar medio de diferenciación libre de suero (SFD) de acuerdo con la Tabla 1. Utilice este medio desde el día 0 hasta el día 5 de diferenciación. Prepare un medio libre de suero para células CD34+ (SFM-34) agregando 34 suplementos de nutrientes y 5 mL de suplemento de L-glutamina al medio basal 34 SFM (ver Tabla de Materiales). Utilice este medio a partir del día 6 de diferenciación. Resuspender 1 mg de CHIR99021 en 716 μL de DMSO para obtener una solución de 3 mM. Incubar a temperatura ambiente hasta que se vuelva a suspender por completo; si es necesario, calentar rápidamente a 37 °C. Prepare alícuotas de 20 μL y guárdelas a -20 °C durante un máximo de 6 meses. Úselo inmediatamente después de descongelarlo y no vuelva a congelarlo ni lo almacene. Vuelva a suspender las citocinas de acuerdo con las instrucciones de la Tabla Suplementaria S1. Almacenar todas las alícuotas de las citocinas a -80 °C. Diferenciación de células endotelialesNOTA: Para cada día de diferenciación, prepare 18 mL (3 mL de medio/pocillo) de medio SFD precalentado, de acuerdo con las mezclas de citocinas descritas en el Cuadro 2.Día 0 – formación de cuerpos embrioides (EBs)Prepare 18 mL de medio SFD con la citocina Mix 1 de acuerdo con la Tabla 2, para cada placa de 6 pocillos (3 mL/pocillo). Agregue 2 ml de medio SFD precalentado con citocina Mix 1 en cada pocillo de una placa de 6 pocillos repelente de células (consulte la Tabla de materiales). Para formar EB, siga los pasos descritos en los pasos 1.3.2.2-1.3.2.4.NOTA: Asegúrese de que las hiPSC sean 70-80% confluentes para iniciar la diferenciación. Agregue 1 mL de medio SFD precalentado con citocinas Mix 1 a cada pocillo de grupos de células separadas. Utilice una pipeta Pasteur para transferir suavemente los grupos celulares a un solo pocillo de pocillo repelente celular para la formación de EB en una proporción de 1:1. Después de colocar la placa en la incubadora, muévala hacia adelante y hacia atrás, hacia la derecha y hacia la izquierda, para dispersar los EB de manera uniforme en el pozo. Día 1 – cambio medio en los EBNOTA: Este paso solo es necesario si, para el día 1 de diferenciación, hay muchas células individuales en suspensión junto con los EB.Prepare 18 mL de medio SFD con la citocina Mix 1 de acuerdo con la Tabla 2, para cada placa de 6 pocillos (3 mL/pocillo). Agite la placa con los EB para moverlos hacia el centro y recójalos con una pipeta Pasteur en un tubo de centrífuga de 15 ml.NOTA: Si los EB se ven agrupados como en cadenas, sepárelos pipeteándolos hacia arriba y hacia abajo con un P1000 antes de recogerlos en el tubo de centrífuga de 15 ml. Espere de 5 a 10 minutos para que los EB se asienten en el fondo del tubo.NOTA: Si los EB son demasiado pequeños, centrifugérelos durante 5 minutos a 100 × g para ayudarlos a asentarse. Lave las placas repelentes de células con agua estéril o DPBS para eliminar cualquier célula individual o residuo. Aspire cuidadosa y lentamente el sobrenadante de los EB sin desalojarlos. Agregue 2 ml de SFD con citocinas Mix 1 a cada pocillo de las placas repelentes celulares. Vuelva a suspender los EB usando 1 ml de medio SFD con citocinas Mix 1 para cada pocillo inicial: para una placa de 6 pocillos, agregue 6 ml de medio. Transfiera los EB a las placas repelentes de células en un volumen de 1 mL por pocillo, que ya contiene 2 mL de medio SFD. Después de colocar la placa en la incubadora, muévala hacia adelante y hacia atrás, hacia la derecha y hacia la izquierda, para dispersar los EB de manera uniforme en el pozo. Día 2 – adición de CHIR99021Gire los EB en el centro de la placa y agregue CHIR99021 de acuerdo con la Tabla 2 en el costado del pocillo para evitar el contacto directo con las celdas.NOTA: Si el medio no se cambió en el día 1, reemplace todo el medio en lugar de agregar CHIR solo. Prepare 18 mL de medio SFD con la Mezcla 2 de acuerdo con la Tabla 2, para cada placa de 6 pocillos (3 mL/pocillo). Después de colocar la placa en la incubadora, muévala hacia adelante y hacia atrás, hacia la derecha y hacia la izquierda, para dispersar los EB de manera uniforme en el pozo. Día 3 – cambio medio en los EB y adición de citocinas Mix 3Prepare 18 mL de medio SFD con Mezcle 3 citocinas de acuerdo con la Tabla 2, para cada placa de 6 pocillos (3 mL/pocillo). Recoja los EB como se describe en los pasos 2.2.2.2-2.2.2.4. Agregue 2 ml precalentados de medio SFD con citocinas Mix 3 a las placas repelentes celulares. Aspire con cuidado el sobrenadante de los EB. Agregue 1 mL/pocillo de SFD con Mix 3 citocinas. Distribuya los EB entre los pocillos como se describe en los pasos 2.2.2.8-2.2.2.9. Día 6 – cambio medio para SFM-34 y adición de citocinas Mix 4Prepare 18 mL de medio SFD con Mezcle 4 citocinas de acuerdo con la Tabla 2, para cada placa de 6 pocillos (3 mL/pocillo). Recoja los EB como se describe en los pasos 2.2.2.2-2.2.2.4. Agregue 2 ml de medio SFM-34 precalentado con citocinas Mix 4 a las placas repelentes celulares. Aspire con cuidado el sobrenadante de los EB. Agregue 1 mL/pocillo de SFM-34 con la mezcla de 4 citocinas. Distribuya los EB entre los pocillos como se describe en los pasos 2.2.2.8-2.2.2.9. 3. Aislamiento de células CD34+ y siembra en el chip NOTA: Las células CD34+ se aíslan mediante un enfoque de aislamiento positivo con un kit de microesferas CD34 (consulte la Tabla de materiales), que contiene microesferas CD34 conjugadas con anticuerpos monoclonales de ratón, anticuerpos anti-CD34 humanos y reactivo de bloqueo de FcR (IgG humana). Es importante validar la eficiencia del aislamiento de la columna mediante la tinción de células antes y después del aislamiento para el análisis de citometría de flujo, a continuación se indica cuándo es necesario tomar células para este análisis. Preparar materiales y reactivos.Prepare el tampón de lavado agregando 5 ml de solución de BSA al 5% y 200 μl de EDTA 0,5 M a 45 ml de DPBS para obtener PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA. Prepárese fresco para cada aislamiento, esterilie con filtro y manténgalo refrigerado hasta su uso. Recubra las virutas fluídicas con una solución de laminina preparada diluyendo la rhLaminin 521 1:50 en DPBS Ca 2+ Mg2+. Cubra cada viruta con el volumen adecuado para la viruta en uso e incube en la incubadora durante 2 h antes de la siembra.NOTA: Se pueden emplear otras matrices para el recubrimiento y deben probarse para el tipo de célula / experimento específico. Prepare el medio Mix 4 SFM-34 suplementando 18 mL de medio SFM-34 con citocinas Mix 4 de acuerdo con la Tabla 2 y coloque la mezcla en un tubo de 50 mL en la incubadora con la tapa ligeramente desenroscada para facilitar el intercambio de gases. Coloque los equipos de perfusión seleccionados y cualquier otro tubo que se vaya a utilizar en la incubadora para desgasificar. Día 8 – disociación de EBs y aislamiento de CD34+Recopile los EB como se describe en los pasos 2.2.2.2-2.2.2.5. Agregue 1 mL de reactivo de disociación celular por cada pocillo inicial de EB recolectados (si se recolectaron 6 pocillos, agregue 6 mL). Transfiera de nuevo 1 ml de la suspensión de EB en el reactivo de disociación celular a cada pocillo de la placa repelente celular. Incubar durante 10 minutos en la incubadora. Pipetee suavemente los EB hacia arriba y hacia abajo contra el pocillo con un P1000, no más de 10 veces. Repita los pasos 3.2.4-3.2.5.para un total de 3 veces.NOTA: Si los EB son difíciles de disociar, repita los pasos anteriores 4 veces en total. Agregue 5 ml de tampón de lavado por cada pocillo de EB disociados. Recoja las células en un tubo de centrífuga de 50 ml pasándolas por un colador de 40 μm. Tome 10 μL de la suspensión celular para contar las células.NOTA: Para probar la eficiencia del aislamiento, transfiera 105 células/tubo a dos tubos diferentes (control sin tinción y muestra de prueba preclasificada) que se utilizarán posteriormente para la citometría de flujo (como se describe en los pasos 4.3.9-4.3.13). Para una placa de 6 pocillos, se deben recolectar ~ 106 celdas después de la filtración. Girar las celdas hacia abajo durante 10 minutos a 300 × g. Vuelva a suspender las células en 300 μL de tampón de lavado, pipeteando suavemente unas cuantas veces para asegurarse de que no haya grumos. Continúe siguiendo el protocolo del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Siembra de células CD34+ en chips fluídicosNOTA: El chip fluídico utilizado en el protocolo tiene una altura de canal de 0,6 mm y una longitud de 50 mm, para un área de crecimiento total de 2,5cm2 (Figura suplementaria S1). Este tipo de chip se siembra con un volumen total de suspensión celular de 150 μL. Se pueden utilizar diferentes chips, y el volumen de siembra y la densidad celular deben adaptarse de acuerdo con el área de crecimiento. Es posible que se necesite una optimización adicional dependiendo de la línea celular utilizada y su crecimiento.Resuspender las células CD34+ aisladas en 300 μL de medio SFM-34 precalentado con citocinas Mix 4. Tome 10 μL de la suspensión celular y cuente las células. Resuspender 2,5 × 105 células en un volumen final de 150 μL suplementado con SFM-34; añadir 0,5 μL de iRock.NOTA: Para probar la eficiencia del aislamiento, transfiera 105 células/tubo a un tubo (muestra de prueba clasificada posteriormente) que se utilizará posteriormente para la citometría de flujo (como se describe en los pasos 4.3.9-4.3.13). Aspire lentamente la laminina de las virutas fluídicas colocando la punta de un P200 dentro del depósito en el borde del canal.NOTA: Si el líquido es difícil de recolectar, levante lentamente un lado de la viruta para ayudar a que el líquido se mueva hacia el depósito opuesto. Agregue la suspensión celular de manera constante en el canal para asegurarse de que no se formen burbujas.NOTA: Realice los pasos 3.3.4-3.3.5 de forma rápida pero suave para evitar que la laminina se seque y se formen burbujas en los canales de la viruta. Si se forman burbujas, levante un lado del chip y golpee suavemente el portaobjetos para movilizar las burbujas; Cuando lleguen al embalse, subirán a la interfaz aérea y no deberían poder volver a entrar en el canal. Transfiera el chip a la incubadora y déjelos toda la noche para que las células estén completamente unidas al canal y se vean alargadas. Cuando las células estén completamente adheridas, aspire el medio como en el paso 3.3.4 y reemplácelo con 200 μL de SFM-34 suplementado con citocinas. A partir de ahora, reemplace el medio diariamente hasta que las células hayan alcanzado el 90%-100% de confluencia. 4. Aplicación de flujo continuo a las células endoteliales – Aorta-on-a-chip Preparar materiales y reactivos.Prepare el medio Mix 4 SFM-34 suplementando 18 mL de medio SFM-34 con citocinas Mix 4 de acuerdo con la Tabla 2 y colóquelo en un tubo de 50 mL en la incubadora con la tapa ligeramente desenroscada para facilitar el intercambio de gases. Coloque los equipos de perfusión seleccionados y cualquier tubo que se utilizará para la configuración fluídica en la incubadora para desgasificar. Montaje del sistema fluídicoInstale el equipo de perfusión en la unidad de acuerdo con el protocolo del fabricante.NOTA: Recuerde utilizar abrazaderas en el sistema. Si se utilizan abrazaderas deslizantes para este paso, deben deslizarse sobre el tubo antes de conectarlas al chip. Coloque un nuevo chip fluídico y agregue el medio SFM-34 suplementado con citocinas, asegurándose de llenar ambos depósitos en condiciones estériles en la campana. Realice el programa de eliminación de burbujas y el paso de calibración. Retire la unidad fluídica con el conjunto conectado de la incubadora y transfiérala a la campana; Tome también las fichas que contienen las células de la incubadora. Sujete el tubo a ambos lados del chip de prueba. Retire el tubo del chip de prueba.NOTA: Verifique que no haya burbujas en el conector Luer en el extremo de la tubería. Si hay burbujas visibles, aspire con cuidado con una pipeta P200 y, si es necesario, agregue más medio para asegurarse de que el conector esté lleno de medio. Conecte el chip que contiene las celdas con el tubo. Retire o abra las abrazaderas. Transfiera el sistema a la incubadora y conecte la bomba de aire a la unidad de fluídicos. Inicie el programa preseleccionado utilizando el software dedicado a la bomba (Figura complementaria S2) con el aumento gradual del esfuerzo cortante descrito en la Tabla 3.NOTA: Dependiendo del experimento específico que se necesite, es posible que sea necesario optimizar el programa de estimulación. Aquí se describe un aumento gradual de la tensión cortante que conduce al valor final de 5 dyn/cm2, que imita la tensión cortante calculada que experimenta la pared de la aorta dorsal al inicio de la circulación fetal 9. Independientemente del esfuerzo cortante final que se empleará, es necesario aumentar gradualmente con el tiempo para permitir que las celdas se adapten a la fuerza sin hacer que las celdas se desprendan del chip. Si el protocolo de estimulación seleccionado dura más de 3 días, las citocinas deben recargarse en el sistema añadiendo 1 ml de SFM-34 que contenga las citocinas Mix 4 que normalmente se añadirían a 18 ml. Para ello, el programa de la bomba se detiene rápidamente y se añaden 500 μL de medio suplementado a cada una de las dos jeringas del conjunto de fluidos. Recolección de células para análisisPrecalentar el tampón de disociación en un baño de agua. Retire la unidad fluídica de la incubadora y colóquela en la campana. Sujete el tubo que flanquea la viruta en ambos lados y retire el tubo de los depósitos de la viruta. Retire suavemente el medio del chip y reemplácelo con DPBS Ca 2+ Mg2+ para lavar las células. NOTA: Este paso de lavado con PBS se puede omitir si las células comienzan a desprenderse. Añadir suavemente 150 μL de tampón de disociación e incubar durante 3 min a 37 °C.NOTA: Verifique bajo el microscopio si las células son individuales y separadas; de lo contrario, incube durante 2 minutos más. Es esencial que las células se separen completamente del canal antes de aspirar el medio, ya que el chip no permite ayudar al desprendimiento celular mediante pipeteo. Se pueden emplear otras soluciones para separar las células, como tampones basados en tripsina o EDTA. Recoja el tampón de disociación que contiene las células de un depósito y transfiéralo a un tubo de centrífuga de 15 ml y lave el canal una vez con DPBS para recoger todas las células desprendidas. Agregue 1 ml de tampón de lavado al tubo de 15 ml con las células y tome 10 μl para contar las células. Divida la suspensión celular en tubos de citometría de flujo para tener de 10a 5 células por tubo de ensayo. Girar los tubos durante 5 min a 300 × g. Prepare la solución de tinción para tener 50 μL por cada tubo de ensayo para teñir. Añadir el CD34 PerCP-efluor710 o CD34-PE a 1:100 y 1:200 de dilución, respectivamente. Resuspender las células en 50 μL de solución de tinción e incubar durante 30 min a 4 °C. Lavar las células añadiendo 2 ml de tampón de lavado y centrifugar durante 5 min a 300 × g. Vuelva a suspender los gránulos en 100 μL de solución de tinción y adquiera los datos con un citómetro de flujo.NOTA: Las células también pueden lisarse directamente en el chip para la extracción de ARN utilizando 150 μL de tampón de lisis de ARN o fijarse para la obtención de imágenes utilizando paraformaldehído al 4% en DPBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Análisis de la orientación de las célulasAnalice las imágenes para cuantificar los cambios en la orientación de las celdas utilizando FIJI23 (Figura suplementaria S3).Abra el administrador de regiones de interés (ROI) desde el menú Analizar | Herramientas | Menú del gestor de ROI . Dibuje los contornos de celda manualmente con la herramienta de selección de polígonos y agréguelos al administrador de ROI haciendo clic en Agregar o usando el acceso directo CTRL+T . Mida la orientación de cada ROI eligiendo la medida Ajustar elipse en el menú Analizar | Menú Establecer medidas . Aplique la medición a todos los ROI a través de la Más… Comando de medición múltiple en el administrador de ROI.NOTA: Este paso ajustará una elipse a cada ROI y generará una tabla que contiene la longitud de los ejes de elipse mayor y menor, así como el ángulo. Exporte la tabla a un archivo CSV para importarla a otro software para trazarla.NOTA: El script utilizado para los gráficos está disponible en https://gist.github.com/nicolaromano/708b3231d730ee7f70763a7cf8850DDC.