Cerrahi olmayan embriyo transferi veya suni tohumlamadan önce vazektomize erkeklere ihtiyaç duymadan dişi farelerde yalancı gebeliğin indüklenmesi
Summary
Sunulan servikal manipülasyon yöntemi, vazektomize erkeklerle üreme dişilerine gerek kalmadan farelerde yalancı gebeliği indükleyebilir. Yalancı gebelik indüksiyonu, her ikisi de sunulan ameliyatsız embriyo transferi ve ameliyatsız suni tohumlamanın başarısı için gereklidir.
Abstract
Embriyo transferi veya suni tohumlama ile hamileliği başarılı bir şekilde sürdürmek için, dişi alıcı fareler psödogebe duruma sokulmalıdır. Dişi fareler geleneksel olarak gece boyunca vazektomize edilmiş erkeklerle eşleştirilir ve ertesi sabah bir çiftleşme tıkacının varlığı değerlendirilir. Yalancı gebe dişilerin üretilmesinin etkinliğini artırmak için, farelerde cerrahi olmayan embriyo transferi veya suni tohumlama teknikleri ile birlikte kullanılmak üzere bir servikal manipülasyon tekniği standardize edilmiştir. Küçük bir plastik çubuğun kör ucu, rahim ağzına temas edecek şekilde vajinal yoldan sokulur ve bir düzeltici ile temas ettirilerek 30 saniye boyunca titreştirilir. İşlem hızlıdır ve anestezi veya analjezi gerektirmez. Bu teknik, yalancı gebe dişilerin üretilmesinin güvenilirliğini ve öngörülebilirliğini arttırır ve vazektomize erkek gereksinimini tamamen ortadan kaldırır. CD1 fareleri için, servikal manipülasyon kullanılarak yalancı gebelik indüksiyonunun etkinliği östrusta sahip dişiler için% 83 idi (N = 76), ancak kızgınlıktaki dişilerin sadece% 38’i vazektomize erkekler tarafından tıkandı (N = 24). CD1 farelerinde suni tohumlama, hormonlarla östrus senkronizasyonu, servikal manipülasyon ve spermin uterus transferi ile gerçekleştirildi. Servikal manipülasyon (N = 76) alan suni tohumlama alıcılarının gebelik oranı% 72 ve ortalama yavru büyüklüğü 8.3 yavru idi. Bu yöntem, cerrahi olmayan embriyo transferi için yalancı gebe dişiler üretmek için de kullanılabilir. Bu nedenle, servikal manipülasyon ile yalancı gebeliği indüklemek, cerrahi olmayan yardımcı üreme teknikleri uygularken vazektomili bir erkekle çiftleşmeye uygun ve etkili bir alternatiftir. Servikal manipülasyonun kullanılması, gerekli hayvan sayısını azaltarak ve cerrahi olarak değiştirilmiş erkeklere olan ihtiyacı ortadan kaldırarak yardımcı üreme teknikleri için 3R (değiştirme, azaltma ve iyileştirme) faydaları sağlar.
Introduction
Yardımcı üreme teknolojileri, genetiği değiştirilmiş fare modellerinin üretiminin yanı sıra kriyoprezervasyondan suşların geri kazanılması, suşların tehlikeye atılmış bir sağlık durumundan yeniden türetilmesi ve yaşa uygun kohortların üretimi de dahil olmak üzere stratejik vivaryum yönetimi için kullanılır. Farelerde tüm yardımcı üreme teknikleri, embriyo gelişimi için psödogebe kadın alıcıların kullanılmasını gerektirir. Tarihsel olarak, psödogebe alıcılar, cerrahi olarak vazektomize edilmiş veya genetik olarak kısır olan steril erkeklerle çiftleştirilerek üretilmiştir ve bir çiftleşme tıkacının varlığı ertesi sabahdeğerlendirilir 1. Son zamanlarda, pronükleer veya iki hücreli fare embriyolarının cerrahi transferi için farelerde sonik stimülasyon için bir protokol geliştirilmiştir2. Ayrıca suni tohumlama ve blastosistlerin cerrahi olmayan embriyo transferi ile kullanım için bir servikal manipülasyon (CM) protokolü geliştirdik. Prosedürün kullanılmasının gerekçesi, gerekli hayvan sayısında 3R’lik bir azalma (artık erkek fareler gerektirmeyen) ve kullanılan tekniklerin iyileştirilmesini (artık erkek fareler için cerrahi vazektomi prosedürünü gerektirmeyen) sağlamaktır. Bu protokolün açıklaması, CM’nin normal iş akışlarına entegrasyonuna yardımcı olmak için ilgili yardımcı üreme tekniğini içerir. CM yönteminin genel amacı, suni tohumlama ve embriyo transferi de dahil olmak üzere yardımcı üreme teknikleri için yalancı gebe dişilerin oluşturulmasında erkek farelerin kullanımının yerini almaktır.
Burada açıklanan CM protokolü ilk olarak farelerde suni tohumlamaya yardımcı olmak için geliştirilmiştir. Suni tohumlama protokolü, başlangıçta açıklandığı gibi, ortalama 7 yavru büyüklüğü ile %50’lik bir gebelik oranına ulaşmıştır3. CD1 alıcı fareleri, döllenmeden 47 saat önce hamile kısrak serum gonadotropin (PMSG) ve insan koryonik gonadotropin (hCG) dahil olmak üzere düşük dozda hormonlarla senkronize edildi. Kızgınlık senkronizasyonunun bir avantajı, protokolün normal çalışma saatlerinde kullanılmasına izin vermesiydi. Dişiler, suni tohumlamadan hemen sonra vazektomize edilmiş erkeklerle eşleştirildi ve çiftleşme, bir çiftleşme tıkacının varlığı ile doğrulandı. Alıcılarla çiftleşme oranındaki tutarsızlık, prosedürde bir zorluk olarak bildirildi. Bu nedenle, yalancı gebeliğin indüksiyonu için çiftleşmeye alternatifler arandı.
Bu çalışma, psödogebe kadınların üretim etkinliğini artırmak için standart bir CM tekniği sunmaktadır. Kızgınlık veya proöstrus hastası dişiler için, küçük bir plastik çubuğun kör ucu rahim ağzına temas edecek şekilde vajinal yoldan sokulur ve bir düzeltici ile temas ettirilerek 30 saniye boyunca titreştirilir. İşlem tel kaplı bir kafes üzerinde gerçekleştirilir. Anestezi veya analjezi gerekmez. CM tekniği, vazektomize erkeklerle çiftleşmeye gerek kalmadan cerrahi olmayan suni tohumlamadan sonra yavru üretebilen yalancı gebe dişiler üretmek için uygundur. CM ayrıca embriyo transferinin alıcıları olarak psödogebe kadınların üretimi için de kullanılabilir. Spesifik olarak, CM tekniği, burada açıklandığı gibi cerrahi olmayan embriyo transferi ile eşleştirilebilir. Farelerde4,5 ve sıçanlarda 6,7 blastosist evresindeki embriyoların embriyo transferi için cerrahi olmayan yöntemlerin etkili olduğu gösterilmiştir. Bu cerrahi olmayan yöntem, cerrahi yöntemlere etkili bir alternatif olduğundan, tekniğin 3R iyileştirmesi olarak kabul edilir. Önceki araştırmalara dayanarak, fekal kortikosteron seviyeleri, stresin bir ölçüsü olarak, prosedürün cerrahi olmayan doğasının kemirgenlerde stres seviyelerini artırmadığını göstermektedir 7,8. Prosedürler cerrahi embriyo transferinden teknik olarak daha az zorlayıcıdır ve gerçekleştirilmesi çok daha hızlıdır. Embriyolar rahime transfer edilirken rahim gelişimi için doğru aşamadaki embriyoların transfer edilmesi gerekir. Fareler için blastosistler, koitumdan (dpc) 2.5 gün sonra psödogebe alıcılara transfer edilir.
Burada tarif edilen iki cerrahi olmayan teknik için, hormon uygulamasının zamanlaması ve CM tekniği farklıdır. CM prosedürünün östrusa göre zamanlaması, psödogebe alıcıların üretimi için doğal çiftleşmenin yerini aldığı için başarı için önemlidir. Bu prosedür, vazektomize erkeklerin yalancı gebeliği indükleme ihtiyacını ortadan kaldırarak, hem gerekli hayvan sayısını azaltarak hem de cerrahi olarak değiştirilmiş erkeklere olan ihtiyacı ortadan kaldırarak 3R fayda sağlar. İşlemin kendisi hızlıdır (30 sn) ve anestezi veya analjezi gerektirmez. Teknik, yardımlı üreme için yalancı gebe dişilerin üretilmesinin güvenilirliğini ve öngörülebilirliğini büyük ölçüde artırır.
Protocol
Representative Results
Discussion
3R, 1959’da Russel ve Burch tarafından “İnsancıl Deneysel Tekniğin İlkeleri”15’te tanımlandığı gibi, araştırmalarda hayvan kullanımı için etik bir çerçevedir. 3R, hayvan kullanımında değiştirme, azaltma ve arıtmayı temsil eder. Burada vurgulanan protokoller 3R ile uyumludur. Servikal manipülasyon tekniği, artık yalancı gebe dişiler üretmek için erkeklerin kullanılmasını gerektirmeyerek ihtiyaç duyulan hayvan sayısını azaltır. Teknik aynı zamanda erkeklerde vazektomi yapma ihtiyacını ortadan kaldırır, böylece ağrı ve sıkıntıyı azaltarak incelik sağlar. Burada tarif edilen yardımcı üreme teknikleri (suni tohumlama ve embriyo transferi) cerrahi değildir ve bu nedenle her ikisi de cerrahi alternatiflerinin neden olduğu ağrı ve sıkıntıyı8azaltarak 3R’lik bir iyileştirme sağlar.
Farelerde yardımcı üreme yapılırken yavruların iyileşmesi için psödogebe dişilerin kullanılması gereklidir1. CM prosedürü, psödogebe dişilerin üretilmesi için etkili bir yöntemdir, ancak alıcı dişilerin kızgınlık döngüsünün fazının senkronizasyonu, süreçte kritik bir ilk adımdır. Öströz senkronizasyon, potansiyel alıcıları hazırlamak için kolonide ihtiyaç duyulan dişi sayısını büyük ölçüde azaltabilir ve talep üzerine zamanlanmış psödogebe dişilerin üretilmesine yardımcı olabilir. Düşük dozda hormon kullanmak, CD1 farelerinde canlı yavruların geri kazanılması üzerinde herhangi bir zararlı etkiye neden olmamaktadır. Transfer edilen embriyolar veya spermler için en kaliteli alıcı dişileri üreten hormon ve konsantrasyon kombinasyonunu bulmak için diğer suşlara özen gösterilmelidir. Senkronizasyon, PMSG ve hCG16 kullanılarak sağlanabilir, ancak süperovule dişiler üreten dozlar, sürekli bir hamilelik için uygun olmayabilir17.
Bir dişinin kızgınlık geçirip geçirmediğini belirlemek için bu çalışmada sitolojik bir değerlendirme yapıldı. Kızgınlık fazı, vajinal açıklığın11,18 gözlemlenmesiyle de değerlendirilebilir. Bu yöntem son derece yararlı olmasına ve kendi başına veya doğrulama olarak kullanılabilmesine rağmen, sitolojinin kullanımından daha özneldir. Boyamasız vajinal sitoloji, kızgınlıkta dişileri seçmek için hem hızlı hem de etkilidir, çünkü kornifiye epitel hücreleri kolayca tanımlanabilir. Bu protokolde, potansiyel alıcıları belirlemek için CM’den önce sitolojik değerlendirme yapılır. CM’den önce sitoloji yapmak önemlidir, çünkü prosedür vajinal bölgeden dökülen hücreleri parçalama eğilimindedir, bu da tanımlamayı zorlaştırır. Yalancı gebelik veya gebelik için sitolojik değerlendirme, KM’den (dpcm) 3.5-11.5 gün sonra art arda 3 gün boyunca yapılabilir. Östrus bisikletli bir dişinin profili, kornifiye epitel hücrelerinin önemli ölçüde infiltrasyonu ile en az 1 güne sahip olmalıdır. Yalancı gebe / hamile kadınlar, art arda 3 gün boyunca bir diestrus profili (çoğunlukla potansiyel olarak düşük hücre sayılarına sahip lökositler) göstermelidir.
CM tekniğinin geliştirilmesiyle, bazı farelerin prosedüre diğerlerinden daha açık olduğu bulundu. CD1 dişi fareler, sakin doğaları ve mükemmel besleyici içgüdüleri nedeniyle mükemmel adaylardır. Bu suşun kullanımı kolaydır ve CM ve cerrahi olmayan yardımcı üreme teknikleri sırasında iyi performans gösterir. C57Bl / 6 fareleri daha agresif ve daha az besleyici olma eğilimindedir. Bu protokol, CM kullanarak psödogebe C57Bl / 6 kadınlarını etkili bir şekilde üretirken, prosedüre tutarlı bir şekilde izin verme olasılıkları daha düşüktü. Bu, CM sırasında östrus fazı ile bir şekilde ilişkili görünüyordu. Östrus veya proöstrustaki dişiler daha alıcıydı. Hayvanın girmesi için bir zenginleştirme tüpünün kullanılması, prosedür için vajinaya erişime izin verdi ve dişinin sakinleşmesine yardımcı oldu. Prosedürün kendisi dişiyi tam olarak kısıtlamaz, böylece hayvan herhangi bir zamanda çekilebilir. Bu meydana gelirse, hayvan yeniden konumlandırılabilir ve prosedüre devam edilebilir. Dişi uzaklaşırsa prosedürün zamanlaması durur ve prosedür devam ettirildiğinde devam eder. İşlemin başarısı için kritik olan, östrus döngüsünün fazı (geç proöstrus ve östrus) ve çubuğun serviks ile temasıdır. Düzelticinin titreşimi standartlaştırılmış CM sağlar. Serviks ile teması sağlamak için çubuğa hafif bir basınç uygulanır ve çubuğun rahim ağzına karşı konumlandırılması, çubuğun küçük ileri geri hareketleriyle sağlanır.
CM kullanımı NSAI protokolünü geliştirmiştir, çünkü östrus döngüsünün doğru fazındaki dişiler sperm transferinden önce seçilebilir ve protokol artık vazektomize erkeklerle çiftleşmeye bağlı değildir. Suni tohumlama östrus döngüsü senkronizasyonu, oosit olgunlaşması 4. günün sabahı sperm transferine karşılık gelecek şekilde zamanlanır. Protokolün başarısı için kritik olan, yumurtlama zamanlamasının döllenmenin gerçekleşebileceği şekilde uyarlanmasıdır. İn vitro fertilizasyon için kullanılan zamanlamalar için önerildiği gibi, beklenen sperm transferinden 15-17 saat önce hCG uygulanmasına özen gösterilmelidir1. Sperm örneğinin kalitesi suni tohumlamanın sonucunu doğrudan etkileyecektir. Kapasitif hale getirilmiş taze spermler en iyi performansı gösterecektir. İyi kalitede dondurularak saklanmış sperm, in vivo olarak döllenmiş embriyolar üretebilir. Bununla birlikte, uterus boynuzuna aktarılan artık kriyoprotektanlar implantasyonu engelleyebileceğinden, çözülmüş spermin doğrudan transferine dikkat edilmelidir (yayınlanmamış gözlemler).
CM’nin embriyo transferi ile birlikte kullanılması kavramsal olarak kolay bir adaptasyondur. Öströz döngü senkronizasyonu, alıcı havuzunu oluşturmak için gerekli olan dişi sayısını azaltır. CM’den önce östrus evresinin belirlenmesi, psödogebe alıcıların elde edilme olasılığını artırır. Yöntemin bir dezavantajı, embriyo transferi sırasında alıcıların sitolojisinin bir akış aşamasında olmasıdır. Dişi östrustan psödogebelik profiline geçiyorsa tüm hücre tipleri mevcuttur ve psödogebelik ancak sitoloji birkaç gün izlenirse belirgin hale gelir. CD1 ve C57Bl/6 fareler için östrustan psödogebeliğe geçişin başarısına (%>80) dayanarak, bu yöntemin embriyo transferi alıcıları için uygun olması beklenmektedir. Ön sonuçlar, sınırlı cerrahi olmayan embriyo transferi ile iyi bir başarı göstermektedir. Genel olarak, cerrahi olmayan embriyo transferinin etkinliği, cerrahi teknikle4,5 karşılaştırılabilir ve cerrahi olmayan transfer, blastosist aşamasında cerrahi embriyo transferlerinin yerini alabilir. Daha erken evre embriyolar için blastosist aşamasına embriyo kültürü gereklidir. Bununla birlikte, cerrahi bir transfer tercih edilirse, CM tekniğini uygun psödogebe alıcılar için gereken doğru zamanlamaya uyarlamak mümkündür2. Genel olarak, embriyo alıcıları embriyodan 1 gün daha az ilerlemiştir. Örneğin, blastokistler donörlerden 3.5 dpc’de toplanır ve 2.5 dpc alıcılarına aktarılır. Bu nedenle, CM’nin, alıcının embriyolardan daha az gelişmiş bir psödogebe durumunda olacağı şekilde yapılması gerekecektir.
Sonuç olarak, burada özetlenen CM tekniği, fareler için diğer yardımcı üreme teknikleriyle entegrasyon için mükemmel bir umut vaat etmektedir. Suni tohumlama ve embriyo transferi için ameliyatsız teknikler kullanılarak başarılı protokoller sağladık. Kombinasyon halinde, CM tekniği, (1) vazektomili erkeklere olan ihtiyacı ortadan kaldırarak hayvan sayısında bir azalma ve (2) cerrahi teknikleri cerrahi olmayan alternatiflerle değiştirerek tekniklerin iyileştirilmesi dahil olmak üzere 3R avantajları sağlar.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu yayında bildirilen araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Araştırma Altyapısı Programları Ofisi Direktörlüğü Ofisi tarafından R43OD020304 Numaralı Ödül ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü tarafından R44MH122117 Numaralı Ödül ile desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin resmi görüşlerini temsil etmeyebilir.
Materials
| Blastocyst stage embryos | |||
| CARD Fertiup Preincubation Medium (PM) | CosmoBio | KYD-002-EX | For sperm capacitation |
| Embryo handling pipette | Cook Medical | K-FPIP-1120-10BS | Flexipet is available in various diameters |
| Embryo handling pipette assembly | Paratechs | 90010 | |
| Female mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | Toothed, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | Curved, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 | Fine, for dissection |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | Optional |
| human Chorionic Gonadotropin (hCG) | Prospec | hor-250 | For estrus synchronization |
| Incubator, 37 °C 5% CO2 | Thermo Scientific | ||
| Incubator, 37 °C, benchtop | Cook | K-MINC-1000 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | Absorbant tissues |
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | Embryo handling medium |
| Male mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| mC&I device | ParaTechs | 60020 | For sperm transfer, specula included |
| mCM rod | ParaTechs | 90050 | Smooth, blunt, with a diameter @3 mm |
| Microscope | Olympus | SZX7 | 20x and 40x magnification with transmitted and reflected illumination source for embryo work and dissections |
| Microscope | ACCU-SCOPE | 3032 | 100x magnification with bright field illumination |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| mNSET device | ParaTechs | 60010 | For embryo transfer, specula included |
| Needles, 26 G | Exel | 26402 | |
| Papanicolaou Staining System | VWR | 76265-730 | Optional |
| Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 18512 | |
| Pipette, P200 | Corning | 4074 | Fits the C&I device for sperm transfer |
| Pipette, PR-2 | Rainin | 17008648 | Fits the NSET device for embryo transfer |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | Prospec | hor-272 | For estrus synchronization |
| Scale | American Weigh Scales | LB-1000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Dissection |
| Scissors | Fine Science Tools | 14081-09 | Angled, dissection |
| Swabs, Constix | Contec | SC-4 | For vaginal cytology |
| Syringes, 1 cc | Becton Dickenson and Company | 309659 | |
| Tissue culture dishes, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Tissue culture dishes, 60 mm | Falcon | 353004 | |
| Trimmer | Wahl | ChroMini T-Cut | |
| Wire bar topped mouse cage |
References
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. . Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, fourth edition. , (2014).
- Wake, Y., et al. Successful induction of pseudopregnancy using sonic vibration in mice. Scientific Reports. 13 (1), 3604 (2023).
- Stone, B. J., Steele, K. H., Fath-Goodin, A. A rapid and effective nonsurgical artificial insemination protocol using the NSET device for sperm transfer in mice without anesthesia. Transgenic Research. 24 (4), 775-781 (2015).
- Green, M., Bass, S., Spear, B. A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications. BioTechniques. 47 (5), 919-924 (2009).
- Bin Ali, R., et al. Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer. Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).
- Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro. Theriogenology. 151, 81-85 (2020).
- Stone, B. J., et al. A nonsurgical embryo transfer technique for fresh and cultured blastocysts in rats. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (5), 488-495 (2020).
- Steele, K. H., et al. Nonsurgical embryo transfer device compared with surgery for embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (1), 17-21 (2013).
- Terkel, J., Witcher, J. A., Adler, N. T. Evidence for "memory" of cervical stimulation for the promotion of pregnancy in rats. Hormones and Behavior. 24 (1), 40-49 (1990).
- Kaneko, T., Endo, M., Tsunoda, S., Nakagawa, Y., Abe, H. Simple induction of pseudopregnancy by artificial stimulation using a sonic vibration in rats. Scientific Reports. 10 (1), 2729 (2020).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), e35538 (2012).
- Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: Review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
- Luo, C., et al. Superovulation strategies for 6 commonly used mouse strains. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (4), 471-478 (2011).
- Gates, A. H. Viability and developmental capacity of eggs from immature mice treated with gonadotrophins. Nature. 177 (4512), 754-755 (1956).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
- Hasegawa, A., et al. Efficient and scheduled production of pseudopregnant female mice for embryo transfer by estrous cycle synchronization. Journal of Reproduction and Development. 63 (6), 539-545 (2017).
- Beaumont, H. M., Smith, A. F. Embryonic mortality during the pre- and post-implantation periods of pregnancy in mature mice after superovulation. Journal of Reproduction and Fertility. 45 (3), 437-448 (1975).
- Champlin, A. K., Dorr, D. L., Gates, A. H. Determining the stage of the estrous cycle in the mouse by the appearance of the vagina. Biology of Reproduction. 8 (4), 491-494 (1973).
