Induction d’une pseudogrossesse chez les souris femelles sans avoir besoin de mâles vasectomisés avant le transfert d’embryons non chirurgical ou l’insémination artificielle
Summary
La méthode de manipulation cervicale présentée peut induire une pseudogrossesse chez la souris sans avoir besoin de reproduire des femelles avec des mâles vasectomisés. L’induction de la pseudogrossesse est nécessaire pour le succès du transfert d’embryons non chirurgical et de l’insémination artificielle non chirurgicale, qui sont également présentés.
Abstract
Pour réussir à maintenir la grossesse avec transfert d’embryons ou insémination artificielle, les souris receveuses doivent être induites dans un état de pseudo-enceinte. Les souris femelles sont traditionnellement appariées pendant la nuit avec des mâles vasectomisés, et le lendemain matin, la présence d’un bouchon de copulation est évaluée. Pour augmenter l’efficacité de la production de femelles pseudo-gravides, une technique de manipulation cervicale a été normalisée pour être utilisée en combinaison avec des techniques non chirurgicales de transfert d’embryons ou d’insémination artificielle chez la souris. L’extrémité émoussée d’une petite tige en plastique est insérée par voie vaginale pour entrer en contact avec le col de l’utérus et vibre pendant 30 s par contact avec une tondeuse. La procédure est rapide et ne nécessite pas d’anesthésie ou d’analgésie. Cette technique augmente la fiabilité et la prévisibilité de la production de femelles pseudo-gravides et élimine entièrement le besoin de mâles vasectomisés. Pour les souris CD1, l’efficacité de l’induction de pseudogrossesse par manipulation cervicale était de 83% pour les femelles dans l’oestrus (N = 76), mais seulement 38% des femelles dans l’oestrus ont été bouchées par des mâles vasectomisés (N = 24). L’insémination artificielle chez les souris CD1 a été réalisée par synchronisation de l’oestrus avec les hormones, manipulation cervicale et transfert utérin de sperme. Les receveuses d’insémination artificielle recevant une manipulation cervicale (N = 76) avaient un taux de grossesse de 72 % et une portée moyenne de 8,3 petits. Cette méthode peut également être utilisée pour produire des femelles pseudo-gravides pour le transfert d’embryons non chirurgical. Par conséquent, induire une pseudogrossesse par manipulation cervicale est une alternative pratique et efficace à l’accouplement avec un mâle vasectomisé lors de l’exécution de techniques de procréation assistée non chirurgicales. L’utilisation de la manipulation cervicale offre des avantages 3R (remplacement, réduction et raffinement) pour les techniques de procréation assistée en réduisant le nombre d’animaux nécessaires et en éliminant la nécessité de modifier chirurgicalement les mâles.
Introduction
Les technologies de procréation assistée sont utilisées pour la production de modèles de souris génétiquement modifiés, ainsi que pour la récupération de souches issues de la cryoconservation, la redérivation de souches à partir d’un état de santé compromis et la gestion stratégique des vivariums, y compris la production de cohortes appariées selon l’âge. Toutes les techniques de procréation assistée chez la souris nécessitent l’utilisation de receveuses pseudo-enceintes pour le développement de l’embryon. Historiquement, les receveuses pseudo-enceintes ont été générées par accouplement avec des mâles stériles, qui sont soit vasectomisés chirurgicalement, soit génétiquement infertiles, et la présence d’un bouchon de copulation est évaluée le lendemain matin1. Récemment, un protocole de stimulation sonique chez la souris a été développé pour le transfert chirurgical d’embryons de souris pronucléaires ou bicellulaires2. Nous avons également développé un protocole de manipulation cervicale (CM) pour une utilisation avec l’insémination artificielle et le transfert d’embryons non chirurgical de blastocystes. La raison d’être de l’utilisation de la procédure est de fournir une réduction de 3R du nombre d’animaux requis (ne nécessitant plus de souris mâles) et un raffinement des techniques utilisées (ne nécessitant plus la procédure de vasectomie chirurgicale pour les souris mâles). La description de ce protocole comprend la technique de procréation assistée associée pour faciliter l’intégration de la MC dans les flux de travail normaux. L’objectif global de la méthode CM est de remplacer l’utilisation de souris mâles dans la génération de femelles pseudo-gravides pour les techniques de procréation assistée, y compris l’insémination artificielle et le transfert d’embryons.
Le protocole CM décrit ici a d’abord été développé pour aider à l’insémination artificielle chez la souris. Le protocole d’insémination artificielle, tel que décrit à l’origine, a atteint un taux de grossesse de 50%, avec une portée moyenne de 7 petits3. Les souris receveuses de CD1 ont été synchronisées avec une faible dose d’hormones, y compris la gonadotrophine sérique de jument gravide (PMSG) et la gonadotrophine chorionique humaine (hCG), à un intervalle de 47 heures avant l’insémination. Un avantage de la synchronisation œstrale était qu’elle permettait l’utilisation du protocole pendant les heures normales de travail. Les femelles ont été jumelées avec des mâles vasectomisés immédiatement après l’insémination artificielle, et l’accouplement a été confirmé par la présence d’un bouchon de copulation. L’incohérence du taux d’accouplement avec les receveurs a été signalée comme une difficulté dans la procédure. Par conséquent, des alternatives à l’accouplement ont été recherchées pour l’induction de la pseudogrossesse.
La présente étude présente une technique de MC standardisée pour augmenter l’efficacité de la production de femelles pseudo-gravides. Pour les femelles en oestrus ou proestrus, l’extrémité émoussée d’une petite tige en plastique est insérée par voie vaginale pour entrer en contact avec le col de l’utérus et vibre pendant 30 s par contact avec une tondeuse. La procédure est effectuée sur une cage à dessus métallique. Aucune anesthésie ou analgésie n’est nécessaire. La technique CM est pratique pour produire des femelles pseudo-gravides, qui peuvent produire des portées après une insémination artificielle non chirurgicale sans avoir besoin de s’accoupler avec des mâles vasectomisés. La CM peut également être utilisée pour la production de femelles pseudo-gravides en tant que receveuses de transfert d’embryons. Plus précisément, la technique de MC peut être associée à un transfert d’embryons non chirurgical, comme décrit ici. Les méthodes non chirurgicales se sont révélées efficaces pour le transfert embryonnaire d’embryons au stade de blastocyste chez la souris4,5 et le rat 6,7. Comme cette méthode non chirurgicale est une alternative efficace aux méthodes chirurgicales, elle est considérée comme un raffinement 3R de la technique. D’après des recherches antérieures, les niveaux de corticostérone fécale, en tant que mesure du stress, indiquent que la nature non chirurgicale de la procédure n’augmente pas les niveaux de stress chez les rongeurs 7,8. Les procédures sont moins difficiles techniquement que le transfert d’embryons chirurgical et sont beaucoup plus rapides à réaliser. Comme les embryons sont transférés dans l’utérus, les embryons du bon stade de développement utérin doivent être transférés. Pour les souris, les blastocystes sont transférés à des receveuses pseudo-enceintes 2,5 jours après le coït (dpc).
Pour les deux techniques non chirurgicales décrites ici, le moment de l’administration de l’hormone et la technique de MC diffèrent. Le moment de la procédure de MC par rapport à l’oestrus est important pour le succès, car il remplace l’accouplement naturel pour la production de receveuses pseudo-gravides. En éliminant la nécessité pour les mâles vasectomisés d’induire une pseudogrossesse, cette procédure offre des avantages 3R en réduisant le nombre d’animaux nécessaires et en éliminant la nécessité de modifier chirurgicalement les mâles. La procédure elle-même est rapide (30 s) et ne nécessite pas d’anesthésie ou d’analgésie. La technique augmente considérablement la fiabilité et la prévisibilité de la production de femelles pseudo-gravides pour la procréation assistée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les 3R sont un cadre éthique pour l’utilisation des animaux en recherche, tel que décrit en 1959 par Russel et Burch dans « The Principles of Humane Experimental Technique »15. Les 3R représentent le remplacement, la réduction et le raffinement de l’utilisation des animaux. Les protocoles mis en évidence ici sont alignés sur les 3R. La technique de manipulation cervicale réduit le nombre d’animaux nécessaires en n’exigeant plus l’utilisation de mâles pour produire des femelles pseudo-gravides. La technique élimine également le besoin d’effectuer des vasectomies sur les mâles, offrant ainsi un raffinement en réduisant la douleur et la détresse. Les techniques de procréation assistée décrites ici (insémination artificielle et transfert d’embryons) sont non chirurgicales et offrent donc un raffinement des 3R en réduisant la douleur et la détresse8causées par leurs alternatives chirurgicales.
L’utilisation de femelles pseudo-gravides est nécessaire pour la récupération des petits lors de la procréation assistée chez la souris1. La procédure CM est une méthode efficace pour produire des femelles pseudo-gravides, mais la synchronisation de la phase du cycle œstral des femelles receveuses est une première étape critique du processus. La synchronisation œstreuse peut réduire considérablement le nombre de femelles nécessaires dans la colonie pour préparer les receveuses potentielles et aide à produire des femelles pseudo-gravides chronométrées à la demande. L’utilisation d’une faible dose d’hormones ne semble pas avoir d’effets délétères sur la récupération des portées vivantes chez les souris CD1. Il faut prendre soin avec d’autres souches de trouver la combinaison d’hormones et de concentration qui produit les femelles receveuses de la meilleure qualité pour les embryons ou les spermatozoïdes transférés. La synchronisation peut être réalisée en utilisant la PMSG et l’hCG16, mais les doses qui produisent des femelles surovulées peuvent ne pas être appropriées pour une grossesse prolongée17.
Pour déterminer si une femelle est dans l’oestrus, une évaluation cytologique a été effectuée dans ce travail. La phase œstrale peut également être évaluée par l’observation de l’ouverture vaginale11,18. Bien que cette méthode soit extrêmement utile et puisse être utilisée seule ou comme confirmation, elle est plus subjective que l’utilisation de la cytologie. La cytologie vaginale sans coloration est à la fois rapide et efficace pour choisir les femelles dans l’oestrus car les cellules épithéliales cornées peuvent être facilement identifiées. Dans ce protocole, l’évaluation cytologique est effectuée avant la CM afin de déterminer les receveurs potentiels. Il est important d’effectuer une cytologie avant la CM, car la procédure a tendance à fragmenter les cellules détachées de la région vaginale, rendant ainsi l’identification difficile. L’évaluation cytologique de la pseudogrossesse ou de la grossesse peut être effectuée 3,5 à 11,5 jours après la CM (dpcm) pendant 3 jours consécutifs. Le profil d’une femelle cycliste œstrale devrait avoir au moins 1 jour avec une infiltration considérable de cellules épithéliales cornées. Les femmes pseudo-enceintes/enceintes doivent présenter un profil diestrus (principalement des leucocytes avec un nombre de cellules potentiellement faible) pendant 3 jours consécutifs.
Grâce au développement de la technique CM, certaines souris se sont avérées plus réceptives à la procédure que d’autres. Les souris femelles CD1 sont d’excellentes candidates en raison de leur nature calme et de leur excellent instinct nourricier. Cette souche est facile à manipuler et fonctionne bien pendant les techniques de MC et de procréation assistée non chirurgicale. Les souris C57Bl/6 ont tendance à être plus agressives et moins nourricières. Bien que ce protocole ait effectivement produit des femelles pseudo-gravides C57Bl/6 utilisant la CM, elles étaient moins susceptibles d’être systématiquement permissives à l’égard de la procédure. Cela semblait être quelque peu corrélé avec la phase œstrale pendant la MC. Les femelles en oestrus ou proestrus étaient plus réceptives. L’utilisation d’un tube d’enrichissement pour que l’animal puisse entrer a permis d’accéder au vagin pour la procédure et a aidé à calmer la femelle. La procédure elle-même ne retient pas complètement la femelle, de sorte que l’animal peut s’éloigner à tout moment. Si cela se produit, l’animal peut être repositionné et la procédure peut alors être poursuivie. Le moment de la procédure s’arrête si la femme s’éloigne et reprend lorsque la procédure est reprise. La phase du cycle œstral (proestrus tardif et oestrus) et le contact de la tige avec le col de l’utérus sont essentiels au succès de la procédure. La vibration de la tondeuse fournit une CM standardisée. Pour assurer le contact avec le col de l’utérus, une légère pression est appliquée sur la tige et le positionnement de la tige contre le col de l’utérus est assuré par de petits mouvements de va-et-vient de la tige.
L’utilisation de la CM a amélioré le protocole NSAI, car les femelles dans la phase correcte du cycle œstral peuvent être choisies avant le transfert de spermatozoïdes, et le protocole n’est plus subordonné à l’accouplement avec des mâles vasectomisés. La synchronisation du cycle œstral de l’insémination artificielle est programmée de telle sorte que la maturation ovocytaire corresponde au transfert de spermatozoïdes le matin du jour 4. Le succès du protocole est essentiel à l’adaptation du moment de l’ovulation de manière à ce que la fécondation puisse avoir lieu. Il faut prendre soin d’administrer l’hCG 15-17 h avant le transfert de sperme prévu, comme cela est suggéré pour les moments utilisés pour la fécondation in vitro 1. La qualité de l’échantillon de sperme affectera directement le résultat de l’insémination artificielle. Les spermatozoïdes frais qui ont été capacités seront les plus performants. Des spermatozoïdes cryoconservés de bonne qualité peuvent produire des embryons fécondés in vivo. Cependant, des précautions doivent être prises avec le transfert direct de spermatozoïdes décongelés, car les cryoprotecteurs résiduels transférés dans la corne utérine peuvent inhiber l’implantation (observations non publiées).
L’utilisation de la MC en conjonction avec le transfert d’embryons est conceptuellement une adaptation facile. La synchronisation du cycle œstruel réduit le nombre de femelles nécessaires à la production du pool de destinataires. La détermination du stade œstral avant la MC augmente la probabilité d’obtenir des receveuses pseudo-enceintes. Un inconvénient de la méthode est que la cytologie des receveurs au moment du transfert d’embryons est à un stade de flux. Tous les types de cellules sont présents si la femelle passe du profil œstrus au profil pseudo-grossesse, et la pseudogrossesse ne devient évidente que si la cytologie est suivie pendant plusieurs jours. Sur la base du succès (>80%) de la transition de l’oestrus à la pseudogrossesse pour les souris CD1 et C57Bl/6, cette méthode devrait convenir aux receveuses de transfert d’embryons. Les résultats préliminaires montrent un bon succès avec un transfert limité d’embryons non chirurgicaux. En général, l’efficacité du transfert d’embryons non chirurgical est comparable à celle de la technique chirurgicale4,5, et le transfert non chirurgical peut remplacer les transferts d’embryons chirurgicaux au stade de blastocyste. Pour les embryons à un stade précoce, une culture embryonnaire jusqu’au stade de blastocyste est nécessaire. Cependant, si un transfert chirurgical est préféré, il est possible d’adapter la technique de MC au bon moment nécessaire pour les receveuses pseudo-enceintes appropriées2. En général, les receveurs d’embryons sont 1 jour moins avancés que l’embryon. Par exemple, les blastocystes sont récoltés à 3,5 dpc de donneurs et transférés à 2,5 dpc receveurs. Par conséquent, la CM devra être effectuée de manière à ce que la receveuse soit dans un état de pseudo-grossesse moins développé que les embryons.
En conclusion, la technique de MC décrite ici est très prometteuse pour l’intégration avec d’autres techniques de procréation assistée pour les souris. Nous avons fourni des protocoles efficaces pour l’insémination artificielle et le transfert d’embryons en utilisant des techniques non chirurgicales. En combinaison, la technique CM offre des avantages 3R, y compris (1) une réduction du nombre d’animaux en éliminant le besoin de mâles vasectomisés et (2) un raffinement des techniques en remplaçant les techniques chirurgicales par des alternatives non chirurgicales.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par le Bureau du directeur, Bureau des programmes d’infrastructure de recherche, des National Institutes of Health sous le numéro d’attribution R43OD020304 et l’Institut national de la santé mentale des National Institutes of Health sous le numéro d’attribution R44MH122117. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.
Materials
| Blastocyst stage embryos | |||
| CARD Fertiup Preincubation Medium (PM) | CosmoBio | KYD-002-EX | For sperm capacitation |
| Embryo handling pipette | Cook Medical | K-FPIP-1120-10BS | Flexipet is available in various diameters |
| Embryo handling pipette assembly | Paratechs | 90010 | |
| Female mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | Toothed, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | Curved, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 | Fine, for dissection |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | Optional |
| human Chorionic Gonadotropin (hCG) | Prospec | hor-250 | For estrus synchronization |
| Incubator, 37 °C 5% CO2 | Thermo Scientific | ||
| Incubator, 37 °C, benchtop | Cook | K-MINC-1000 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | Absorbant tissues |
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | Embryo handling medium |
| Male mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| mC&I device | ParaTechs | 60020 | For sperm transfer, specula included |
| mCM rod | ParaTechs | 90050 | Smooth, blunt, with a diameter @3 mm |
| Microscope | Olympus | SZX7 | 20x and 40x magnification with transmitted and reflected illumination source for embryo work and dissections |
| Microscope | ACCU-SCOPE | 3032 | 100x magnification with bright field illumination |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| mNSET device | ParaTechs | 60010 | For embryo transfer, specula included |
| Needles, 26 G | Exel | 26402 | |
| Papanicolaou Staining System | VWR | 76265-730 | Optional |
| Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 18512 | |
| Pipette, P200 | Corning | 4074 | Fits the C&I device for sperm transfer |
| Pipette, PR-2 | Rainin | 17008648 | Fits the NSET device for embryo transfer |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | Prospec | hor-272 | For estrus synchronization |
| Scale | American Weigh Scales | LB-1000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Dissection |
| Scissors | Fine Science Tools | 14081-09 | Angled, dissection |
| Swabs, Constix | Contec | SC-4 | For vaginal cytology |
| Syringes, 1 cc | Becton Dickenson and Company | 309659 | |
| Tissue culture dishes, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Tissue culture dishes, 60 mm | Falcon | 353004 | |
| Trimmer | Wahl | ChroMini T-Cut | |
| Wire bar topped mouse cage |
References
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