Inducir pseudoembarazo en ratones hembra sin necesidad de machos vasectomizados antes de la transferencia embrionaria no quirúrgica o la inseminación artificial
Summary
El método de manipulación cervical presentado puede inducir pseudoembarazo en ratones sin necesidad de reproductoras con machos vasectomizados. La inducción del pseudoembarazo es necesaria para el éxito de la transferencia embrionaria no quirúrgica y de la inseminación artificial no quirúrgica, que también se presentan.
Abstract
Para mantener con éxito el embarazo con transferencia de embriones o inseminación artificial, las hembras receptoras deben ser inducidas a un estado de pseudopreñez. Los ratones hembra se emparejan tradicionalmente durante la noche con machos vasectomizados y, a la mañana siguiente, se evalúa la presencia de un tapón de cópula. Para aumentar la eficiencia de la producción de hembras pseudopreñadas, se ha estandarizado una técnica de manipulación cervical para ser utilizada en combinación con técnicas no quirúrgicas de transferencia embrionaria o inseminación artificial en ratones. El extremo romo de una pequeña varilla de plástico se inserta por vía vaginal para entrar en contacto con el cuello uterino y se hace vibrar durante 30 s por contacto con una recortadora. El procedimiento es rápido y no requiere anestesia ni analgesia. Esta técnica aumenta la fiabilidad y la previsibilidad de la producción de hembras pseudopreñadas y elimina por completo la necesidad de machos vasectomizados. Para los ratones CD1, la eficacia de la inducción del pseudoembarazo mediante la manipulación cervical fue del 83% para las hembras en celo (N = 76), pero solo el 38% de las hembras en celo fueron tapadas por machos vasectomizados (N = 24). La inseminación artificial en ratones CD1 se realizó mediante la sincronización del celo con hormonas, la manipulación cervical y la transferencia uterina de espermatozoides. Las receptoras de inseminación artificial que recibieron manipulación cervical (N = 76) tuvieron una tasa de embarazo del 72% y un tamaño promedio de camada de 8,3 crías. Este método también se puede utilizar para producir hembras pseudopreñadas para la transferencia de embriones no quirúrgicos. Por lo tanto, la inducción de pseudoembarazo mediante manipulación cervical es una alternativa conveniente y eficiente al apareamiento con un macho vasectomizado cuando se realizan técnicas de reproducción asistida no quirúrgicas. El uso de la manipulación cervical proporciona beneficios de las 3R (reemplazo, reducción y refinamiento) para las técnicas de reproducción asistida al reducir el número de animales necesarios y eliminar la necesidad de machos alterados quirúrgicamente.
Introduction
Las tecnologías de reproducción asistida se utilizan para la producción de modelos de ratón modificados genéticamente, así como para la recuperación de cepas a partir de la criopreservación, la rederivación de cepas de un estado de salud comprometido y la gestión estratégica de los viverías, incluida la producción de cohortes de la misma edad. Todas las técnicas de reproducción asistida en ratones requieren el uso de receptoras pseudoembarazadas para el desarrollo embrionario. Históricamente, las receptoras pseudoembarazadas se han generado por apareamiento con machos estériles, que son vasectomizados quirúrgicamente o genéticamente infértiles, y la presencia de un tapón de cópula se evalúa a la mañana siguiente1. Recientemente, se ha desarrollado un protocolo de estimulación sónica en ratones para la transferencia quirúrgica de embriones pronucleares o de ratón de dos células2. También hemos desarrollado un protocolo de manipulación cervical (MC) para su uso con la inseminación artificial y la transferencia embrionaria no quirúrgica de blastocistos. La razón para el uso del procedimiento es proporcionar una reducción de 3Rs en el número de animales necesarios (ya no requiere ratones machos) y un refinamiento de las técnicas utilizadas (ya no es necesario el procedimiento de vasectomía quirúrgica para ratones machos). La descripción de este protocolo incluye la técnica de reproducción asistida asociada para ayudar a la integración de la MC en los flujos de trabajo normales. El objetivo general del método MC es sustituir el uso de ratones machos en la generación de hembras pseudopreñadas por técnicas de reproducción asistida, incluyendo la inseminación artificial y la transferencia embrionaria.
El protocolo de MC descrito aquí se desarrolló por primera vez para ayudar con la inseminación artificial en ratones. El protocolo de inseminación artificial, tal como se describió originalmente, logró una tasa de preñez del 50%, con un tamaño promedio de camada de 7 crías3. Los ratones receptores de CD1 fueron sincronizados en celo con una dosis baja de hormonas, incluyendo gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG) y gonadotropina coriónica humana (hCG), en un intervalo de 47 h antes de la inseminación. Una ventaja de la sincronización estral era que permitía el uso del protocolo durante las horas normales de trabajo. Las hembras fueron emparejadas con machos vasectomizados inmediatamente después de la inseminación artificial, y el apareamiento fue confirmado por la presencia de un tapón de cópula. La inconsistencia en la tasa de apareamiento con los receptores fue reportada como una dificultad en el procedimiento. Por lo tanto, se buscaron alternativas al apareamiento para la inducción del pseudoembarazo.
En el presente estudio se presenta una técnica estandarizada de MC para aumentar la eficiencia de la producción de hembras pseudopreñadas. En el caso de las hembras en celo o celo, el extremo romo de una pequeña varilla de plástico se inserta por vía vaginal para entrar en contacto con el cuello uterino y se hace vibrar durante 30 s por contacto con una recortadora. El procedimiento se realiza en una jaula con tapa de alambre. No se requiere anestesia ni analgesia. La técnica de MC es conveniente para la producción de hembras pseudopreñadas, que pueden producir camadas después de una inseminación artificial no quirúrgica sin necesidad de apareamiento con machos vasectomizados. La MC también se puede utilizar para la producción de hembras pseudopreñadas como receptoras de la transferencia de embriones. Específicamente, la técnica de MC se puede combinar con la transferencia de embriones no quirúrgica, como se describe aquí. Los métodos no quirúrgicos han demostrado ser eficaces para la transferencia embrionaria de embriones en estadio de blastocisto en ratones 4,5y ratas 6,7. Como este método no quirúrgico es una alternativa eficaz a los métodos quirúrgicos, se considera un refinamiento de las 3R de la técnica. Con base en investigaciones previas, los niveles de corticosterona fecal, como medida de estrés, indican que la naturaleza no quirúrgica del procedimiento no aumenta los niveles de estrés en roedores 7,8. Los procedimientos son menos desafiantes técnicamente que la transferencia quirúrgica de embriones y son mucho más rápidos de realizar. A medida que los embriones se transfieren al útero, se deben transferir embriones de la etapa correcta para el desarrollo uterino. En el caso de los ratones, los blastocistos se transfieren a receptoras pseudoembarazadas 2,5 días después del coito (dpc).
Para las dos técnicas no quirúrgicas descritas aquí, el momento de la administración de la hormona y la técnica de MC difieren. El momento del procedimiento de MC en relación con el celo es importante para el éxito, ya que reemplaza el apareamiento natural para la producción de receptoras pseudoembarazadas. Al eliminar la necesidad de que los machos vasectomizados induzcan el pseudoembarazo, este procedimiento proporciona los beneficios de las 3R al reducir el número de animales necesarios y eliminar la necesidad de machos alterados quirúrgicamente. El procedimiento en sí es rápido (30 s) y no requiere anestesia ni analgesia. La técnica aumenta en gran medida la fiabilidad y la previsibilidad de la producción de hembras pseudopreñadas para reproducción asistida.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las 3R son un marco ético para el uso de animales en la investigación, tal como lo describen en 1959 Russel y Burch en “The Principles of Humane Experimental Technique”15. Las 3R representan el reemplazo, la reducción y el refinamiento en el uso de animales. Los protocolos destacados aquí están alineados con las 3R. La técnica de manipulación cervical reduce el número de animales necesarios al no requerir el uso de machos para producir hembras pseudopreñadas. La técnica también elimina la necesidad de realizar vasectomías en los hombres, lo que proporciona refinamiento al reducir el dolor y la angustia. Las técnicas de reproducción asistida aquí descritas (inseminación artificial y transferencia embrionaria) son no quirúrgicas, por lo que ambas proporcionan un refinamiento de las 3R al reducir el dolor y la angustia8causados por sus alternativas quirúrgicas.
El uso de hembras pseudopreñadas es necesario para la recuperación de las crías cuando se realiza reproducción asistida en ratones1. El procedimiento de MC es un método eficaz para producir hembras pseudopreñadas, pero la sincronización de la fase del ciclo estral de las hembras receptoras es un primer paso crítico en el proceso. La sincronización estral puede reducir drásticamente el número de hembras necesarias en la colonia para preparar a los posibles receptores y ayuda a producir hembras pseudopreñadas programadas a demanda. El uso de una dosis baja de hormonas no parece causar ningún efecto deletéreo en la recuperación de camadas vivas en ratones CD1. Se debe tener cuidado con otras cepas para encontrar la combinación de hormonas y concentración que produzca las hembras receptoras de mejor calidad para los embriones o espermatozoides transferidos. La sincronización puede lograrse utilizando PMSG y hCG16, pero las dosis que producen hembras superovuladas pueden no ser apropiadas para un embarazo sostenido17.
Para determinar si una hembra se encuentra en celo, en este trabajo se realizó una evaluación citológica. La fase estral también puede ser evaluada por la observación de la abertura vaginal11,18. Si bien este método es extremadamente útil y se puede usar por sí solo o como confirmación, es más subjetivo que el uso de la citología. La citología vaginal sin tinción es rápida y eficaz para elegir hembras en celo porque las células epiteliales cornificadas se pueden identificar fácilmente. En este protocolo, la evaluación citológica se realiza antes de la MC para determinar los posibles receptores. Es importante realizar la citología antes de la MC, ya que el procedimiento tiende a fragmentar las células desprendidas de la zona vaginal, lo que dificulta su identificación. La evaluación citológica para pseudoembarazo o embarazo se puede realizar a los 3,5-11,5 días después de la MC (mcd) durante 3 días consecutivos. El perfil de una hembra ciclista en celo debe tener al menos 1 día con una infiltración considerable de células epiteliales cornificadas. Las hembras pseudogestantes/preñadas deben mostrar un perfil de diestro (en su mayoría leucocitos con un número de células potencialmente bajo) durante 3 días consecutivos.
A través del desarrollo de la técnica CM, se descubrió que algunos ratones eran más receptivos al procedimiento que otros. Los ratones hembra CD1 son excelentes candidatos debido a su naturaleza tranquila y sus excelentes instintos de crianza. Esta cepa es fácil de manejar y se comporta bien durante la MC y las técnicas de reproducción asistida no quirúrgica. Los ratones C57Bl/6 tienden a ser más agresivos y menos cariñosos. Si bien este protocolo produjo efectivamente hembras C57Bl/6 pseudoembarazadas que usaron MC, era menos probable que fueran consistentemente permisivas con el procedimiento. Esto pareció correlacionarse de alguna manera con la fase estral durante la MC. Las hembras en celo o proestro fueron más receptivas. El uso de un tubo de enriquecimiento para que el animal entrara permitió el acceso a la vagina para el procedimiento y ayudó a calmar a la hembra. El procedimiento en sí no restringe completamente a la hembra, por lo que el animal puede alejarse en cualquier momento. Si esto ocurre, el animal puede ser reposicionado y el procedimiento puede continuar. El momento del procedimiento se detiene si la hembra se aleja y se reanuda cuando se reanuda el procedimiento. Para el éxito del procedimiento son fundamentales la fase del ciclo estral (celo tardío y celo) y el contacto de la varilla con el cuello uterino. La vibración de la recortadora proporciona CM estandarizado. Para asegurar el contacto con el cuello uterino, se aplica una presión suave a la varilla, y el posicionamiento de la varilla contra el cuello uterino está asegurada con pequeños movimientos hacia adelante y hacia atrás de la varilla.
El uso de MC ha mejorado el protocolo NSAI, ya que las hembras en la fase correcta del ciclo estral pueden elegirse antes de la transferencia de esperma, y el protocolo ya no depende del apareamiento con machos vasectomizados. La sincronización del ciclo estral de la inseminación artificial se cronometra de tal manera que la maduración de los ovocitos corresponde a la transferencia de espermatozoides en la mañana del día 4. Para el éxito del protocolo es fundamental la adaptación del momento de la ovulación de modo que pueda producirse la fecundación. Se debe tener cuidado de administrar hCG 15-17 h antes de la transferencia espermática esperada, como se sugiere para los tiempos utilizados para la fertilización in vitro 1. La calidad de la muestra de semen afectará directamente al resultado de la inseminación artificial. Los espermatozoides frescos que han sido capacitados funcionarán mejor. Los espermatozoides criopreservados de buena calidad pueden producir embriones fertilizados in vivo. Sin embargo, se debe tener cuidado con la transferencia directa de espermatozoides descongelados, ya que los crioprotectores residuales transferidos al asta uterina pueden inhibir la implantación (observaciones no publicadas).
El uso de la MC junto con la transferencia embrionaria es conceptualmente una adaptación fácil. La sincronización del ciclo estral reduce el número de hembras necesarias para producir el grupo receptor. La determinación del estadio estral previo a la MC aumenta la probabilidad de obtener receptoras pseudoembarazadas. Un inconveniente del método es que la citología de las receptoras en el momento de la transferencia embrionaria se encuentra en una etapa de flujo. Todos los tipos de células están presentes si la hembra está en transición del perfil de celo al perfil de pseudoembarazo, y el pseudoembarazo se hace evidente solo si se realiza un seguimiento de la citología durante varios días. Sobre la base del éxito (>80%) de la transición del celo al pseudoembarazo en ratones CD1 y C57Bl/6, se espera que este método sea adecuado para los receptores de transferencia embrionaria. Los resultados preliminares muestran un buen éxito con la transferencia limitada de embriones no quirúrgicos. En general, la eficiencia de la transferencia embrionaria no quirúrgica es comparable a la de la técnica quirúrgica4,5, y la transferencia no quirúrgica puede sustituir a las transferencias embrionarias quirúrgicas en estadio de blastocisto. En el caso de los embriones en estadios más tempranos, se requiere el cultivo de embriones hasta el estadio de blastocisto. Sin embargo, si se prefiere una transferencia quirúrgica, es posible adaptar la técnica de MC al momento correcto necesario para las receptoras pseudoembarazadas apropiadas2. En general, los receptores de embriones están 1 día menos avanzados que el embrión. Por ejemplo, los blastocistos se recolectan a 3,5 dpc de los donantes y se transfieren a receptores de 2,5 dpc. Por lo tanto, será necesario realizar una MC de tal manera que la receptora se encuentre en un estado de pseudoembarazo menos desarrollado que los embriones.
En conclusión, la técnica de MC descrita aquí muestra una excelente promesa para la integración con otras técnicas de reproducción asistida para ratones. Hemos proporcionado protocolos exitosos para la inseminación artificial y la transferencia de embriones utilizando técnicas no quirúrgicas. En combinación, la técnica de MC proporciona ventajas de las 3R, incluyendo (1) una reducción en el número de animales al eliminar la necesidad de machos vasectomizados y (2) un refinamiento de las técnicas al reemplazar las técnicas quirúrgicas con alternativas no quirúrgicas.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por la Oficina del Director, Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación, de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Premio Número R43OD020304 y el Instituto Nacional de Salud Mental de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Premio Número R44MH122117. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Blastocyst stage embryos | |||
| CARD Fertiup Preincubation Medium (PM) | CosmoBio | KYD-002-EX | For sperm capacitation |
| Embryo handling pipette | Cook Medical | K-FPIP-1120-10BS | Flexipet is available in various diameters |
| Embryo handling pipette assembly | Paratechs | 90010 | |
| Female mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | Toothed, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | Curved, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 | Fine, for dissection |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | Optional |
| human Chorionic Gonadotropin (hCG) | Prospec | hor-250 | For estrus synchronization |
| Incubator, 37 °C 5% CO2 | Thermo Scientific | ||
| Incubator, 37 °C, benchtop | Cook | K-MINC-1000 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | Absorbant tissues |
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | Embryo handling medium |
| Male mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| mC&I device | ParaTechs | 60020 | For sperm transfer, specula included |
| mCM rod | ParaTechs | 90050 | Smooth, blunt, with a diameter @3 mm |
| Microscope | Olympus | SZX7 | 20x and 40x magnification with transmitted and reflected illumination source for embryo work and dissections |
| Microscope | ACCU-SCOPE | 3032 | 100x magnification with bright field illumination |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| mNSET device | ParaTechs | 60010 | For embryo transfer, specula included |
| Needles, 26 G | Exel | 26402 | |
| Papanicolaou Staining System | VWR | 76265-730 | Optional |
| Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 18512 | |
| Pipette, P200 | Corning | 4074 | Fits the C&I device for sperm transfer |
| Pipette, PR-2 | Rainin | 17008648 | Fits the NSET device for embryo transfer |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | Prospec | hor-272 | For estrus synchronization |
| Scale | American Weigh Scales | LB-1000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Dissection |
| Scissors | Fine Science Tools | 14081-09 | Angled, dissection |
| Swabs, Constix | Contec | SC-4 | For vaginal cytology |
| Syringes, 1 cc | Becton Dickenson and Company | 309659 | |
| Tissue culture dishes, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Tissue culture dishes, 60 mm | Falcon | 353004 | |
| Trimmer | Wahl | ChroMini T-Cut | |
| Wire bar topped mouse cage |
References
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