تحفيز الحمل الكاذب في إناث الفئران دون الحاجة إلى قطع الأسهر قبل نقل الأجنة غير الجراحي أو التلقيح الاصطناعي
Summary
يمكن لطريقة التلاعب بعنق الرحم المقدمة أن تحفز الحمل الكاذب في الفئران دون الحاجة إلى تربية الإناث مع الذكور الذين تم استئصال الأسهر. مطلوب تحريض الحمل الكاذب لنجاح نقل الأجنة غير الجراحي والتلقيح الاصطناعي غير الجراحي ، وكلاهما مقدم أيضا.
Abstract
للحفاظ على الحمل بنجاح مع نقل الأجنة أو التلقيح الاصطناعي ، يجب حث الفئران المتلقية الإناث في حالة الحمل الكاذب. يتم إقران إناث الفئران تقليديا بين عشية وضحاها مع الذكور الذين تم استئصال الأسهر ، وفي صباح اليوم التالي ، يتم تقييم وجود سدادة الجماع. لزيادة كفاءة إنتاج الإناث الحوامل الزائفة ، تم توحيد تقنية التلاعب بعنق الرحم لاستخدامها مع نقل الأجنة غير الجراحي أو تقنيات التلقيح الاصطناعي في الفئران. يتم إدخال الطرف الحاد لقضيب بلاستيكي صغير عن طريق المهبل للاتصال بعنق الرحم ويهتز لمدة 30 ثانية عن طريق ملامسة أداة التشذيب. الإجراء سريع ولا يتطلب تخديرا أو تسكين. تزيد هذه التقنية من الموثوقية والقدرة على التنبؤ بإنتاج الإناث الحوامل الكاذبة وتلغي تماما متطلبات الذكور الذين تم استئصال الأسهر. بالنسبة للفئران CD1 ، كانت كفاءة تحريض الحمل الكاذب باستخدام معالجة عنق الرحم 83٪ للإناث في شبق (N = 76) ولكن تم توصيل 38٪ فقط من الإناث في شبق من قبل الذكور الذين تم استئصال الأسهر (N = 24). تم إجراء التلقيح الاصطناعي في الفئران CD1 عن طريق تزامن شبق مع الهرمونات ، والتلاعب عنق الرحم ، ونقل الرحم للحيوانات المنوية. كان لدى متلقي التلقيح الاصطناعي الذين يتلقون معالجة عنق الرحم (N = 76) معدل حمل 72٪ ومتوسط حجم فضلات يبلغ 8.3 جرو. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لإنتاج إناث حوامل كاذبة لنقل الأجنة غير الجراحي. لذلك ، فإن تحفيز الحمل الكاذب عن طريق التلاعب بعنق الرحم هو بديل مناسب وفعال للتزاوج مع ذكر مقطوع الأسهر عند إجراء تقنيات الإنجاب المساعدة غير الجراحية. يوفر استخدام التلاعب بعنق الرحم فوائد 3Rs (الاستبدال والتقليل والصقل) لتقنيات الإنجاب المساعدة عن طريق تقليل عدد الحيوانات المطلوبة والقضاء على ضرورة الذكور المعدلة جراحيا.
Introduction
تستخدم تقنيات المساعدة على الإنجاب لإنتاج نماذج الفئران المعدلة وراثيا ، وكذلك استعادة السلالات من الحفظ بالتبريد ، وإعادة اشتقاق السلالات من حالة صحية معرضة للخطر ، والإدارة الاستراتيجية لحظيرة الحيوان ، بما في ذلك إنتاج مجموعات متطابقة مع العمر. تتطلب جميع تقنيات الإنجاب المساعدة في الفئران استخدام متلقات من الإناث الحوامل الزائفات لنمو الجنين. تاريخيا ، تم إنشاء المتلقين الحوامل الزائفة عن طريق التزاوج مع الذكور العقيمة ، والتي إما استئصال الأسهر جراحيا أو العقم وراثيا ، ويتم تقييم وجود سدادة الجماع في صباح اليوم التالي1. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير بروتوكول للتحفيز الصوتي في الفئران للنقل الجراحي لأجنة الفأر النووية أو ثنائية الخلية2. لقد طورنا أيضا بروتوكول معالجة عنق الرحم (CM) للاستخدام مع التلقيح الاصطناعي ونقل الأجنة غير الجراحي للأكياس الأريمية. الأساس المنطقي لاستخدام الإجراء هو توفير تخفيض 3Rs في عدد الحيوانات المطلوبة (لم تعد تتطلب ذكور الفئران) وصقل التقنيات المستخدمة (لم تعد تستلزم إجراء قطع القناة المنوية الجراحي لذكور الفئران). يتضمن وصف هذا البروتوكول تقنية المساعدة على الإنجاب المرتبطة للمساعدة في دمج CM في سير العمل العادي. الهدف العام من طريقة CM هو استبدال استخدام الفئران الذكور في توليد الإناث الحوامل الزائفة لتقنيات الإنجاب المساعدة ، بما في ذلك التلقيح الاصطناعي ونقل الأجنة.
تم تطوير بروتوكول CM الموصوف هنا لأول مرة للمساعدة في التلقيح الاصطناعي في الفئران. حقق بروتوكول التلقيح الاصطناعي ، كما هو موضح في الأصل ، معدل حمل بنسبة 50 ٪ ، بمتوسط حجم القمامة من 7 الجراء3. كانت الفئران المتلقية CD1 متزامنة مع جرعة منخفضة من الهرمونات ، بما في ذلك موجهة الغدد التناسلية في مصل الفرس الحامل (PMSG) وموجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (hCG) ، في فترة 47 ساعة قبل التلقيح. ومن مزايا التزامن الشبق أنه يسمح باستخدام البروتوكول خلال ساعات العمل العادية. تم إقران الإناث مع الذكور الذين تم استئصال الأسهر مباشرة بعد التلقيح الاصطناعي ، وتم تأكيد التزاوج من خلال وجود سدادة الجماع. تم الإبلاغ عن عدم الاتساق في معدل التزاوج مع المتلقين كصعوبة في الإجراء. لذلك ، تم البحث عن بدائل للتزاوج لتحريض الحمل الكاذب.
تقدم هذه الدراسة تقنية CM موحدة لزيادة كفاءة إنتاج الإناث الحوامل الزائفة. بالنسبة للإناث في شبق أو شبق ، يتم إدخال الطرف الحاد لقضيب بلاستيكي صغير عن طريق المهبل للاتصال بعنق الرحم ويهتز لمدة 30 ثانية عن طريق ملامسة أداة تشذيب. يتم تنفيذ الإجراء على قفص يعلوه الأسلاك. لا حاجة للتخدير أو التسكين. تقنية CM ملائمة لإنتاج الإناث الحوامل الكاذبة ، والتي يمكن أن تنتج الفضلات بعد التلقيح الاصطناعي غير الجراحي دون الحاجة إلى التزاوج مع الذكور الذين تم استئصال الأسهر. يمكن أيضا استخدام CM لإنتاج الإناث الحوامل الكاذبة كمتلقين لنقل الأجنة. على وجه التحديد ، يمكن إقران تقنية CM بنقل الأجنة غير الجراحي ، كما هو موضح هنا. لقد ثبت أن الطرق غير الجراحية فعالة في نقل الأجنة في مرحلة الكيسة الأريمية في الفئران4,5 والجرذان 6,7. نظرا لأن هذه الطريقة غير الجراحية هي بديل فعال للطرق الجراحية ، فإنها تعتبر صقلا 3Rs للتقنية. استنادا إلى الأبحاث السابقة ، تشير مستويات الكورتيكوستيرون البرازية ، كمقياس للإجهاد ، إلى أن الطبيعة غير الجراحية للإجراء لا تزيد من مستويات التوتر في القوارض 7,8. الإجراءات أقل تحديا من الناحية الفنية من نقل الأجنة الجراحي وهي أسرع بكثير في الأداء. عندما يتم نقل الأجنة إلى الرحم ، يجب نقل أجنة المرحلة الصحيحة لتطور الرحم. بالنسبة للفئران ، يتم نقل الكيسات الأريمية إلى 2.5 يوم بعد الجماع (dpc) المتلقين الحوامل الزائفة.
بالنسبة للتقنيتين غير الجراحيتين الموصوفتين هنا ، يختلف توقيت إعطاء الهرمون وتقنية CM. توقيت إجراء CM بالنسبة إلى شبق مهم للنجاح ، لأنه يحل محل التزاوج الطبيعي لإنتاج المتلقين الكاذبة. من خلال القضاء على الحاجة إلى الذكور الذين تم استئصال الأسهر للحث على الحمل الكاذب ، يوفر هذا الإجراء فوائد 3Rs من خلال تقليل عدد الحيوانات المطلوبة والقضاء على ضرورة الذكور المعدلة جراحيا. الإجراء نفسه سريع (30 ثانية) ولا يتطلب تخديرا أو تسكين. تزيد هذه التقنية بشكل كبير من الموثوقية والقدرة على التنبؤ بإنتاج الإناث الحوامل الزائفات للمساعدة على الإنجاب.
Protocol
Representative Results
Discussion
3Rs هو إطار أخلاقي لاستخدام الحيوانات في البحث ، كما هو موضح في عام 1959 من قبل راسل وبورش في “مبادئ التقنية التجريبية الإنسانية”15. تمثل 3Rs الاستبدال والتقليل والصقل في استخدام الحيوانات. تتوافق البروتوكولات الموضحة هنا مع 3Rs. تقلل تقنية التلاعب بعنق الرحم من عدد الحيوانات التي تحتاجها من خلال عدم الحاجة إلى استخدام الذكور لإنتاج إناث كاذبة الحوامل. تلغي هذه التقنية أيضا الحاجة إلى إجراء قطع القناة المنوية على الذكور ، وبالتالي توفير الصقل عن طريق تقليل الألم والضيق. تقنيات الإنجاب المساعدة الموصوفة هنا (التلقيح الاصطناعي ونقل الأجنة) غير جراحية ، وبالتالي ، يوفر كلاهما صقلا 3Rs عن طريق تقليل الألم والضيق8الناجم عن بدائلهما الجراحية.
يعد استخدام الإناث الحوامل الزائفات ضروريا لاستعادة الجراء عند إجراء المساعدة على الإنجاب في الفئران1. يعد إجراء CM طريقة فعالة لإنتاج الإناث الحوامل الزائفات ، ولكن تزامن مرحلة الدورة الشحمية للإناث المتلقيات هو خطوة أولى حاسمة في العملية. يمكن أن يقلل التزامن الوحشي بشكل كبير من عدد الإناث اللازمة في المستعمرة لإعداد المتلقين المحتملين ويساعد في إنتاج إناث حاملات كاذبة موقوتة عند الطلب. لا يبدو أن استخدام جرعة منخفضة من الهرمونات يسبب أي آثار ضارة على استعادة الفضلات الحية في الفئران CD1. يجب توخي الحذر مع السلالات الأخرى للعثور على مزيج الهرمون والتركيز الذي ينتج أفضل الإناث المتلقية للأجنة أو الحيوانات المنوية المنقولة. يمكن تحقيق التزامن باستخدام PMSG و hCG16 ، لكن الجرعات التي تنتج إناثا مفرطة التبويض قد لا تكون مناسبة للحمل المستمر17.
لتحديد ما إذا كانت الأنثى في شبق ، تم إجراء تقييم خلوي في هذا العمل. يمكن أيضا تقييم المرحلة الشحمية من خلال ملاحظة الفتحة المهبلية11,18. في حين أن هذه الطريقة مفيدة للغاية ويمكن استخدامها بمفردها أو كتأكيد ، إلا أنها أكثر ذاتية من استخدام علم الخلايا. علم الخلايا المهبلية دون تلطيخ سريع وفعال على حد سواء لاختيار الإناث في شبق لأنه يمكن التعرف على الخلايا الظهارية المتقرنة بسهولة. في هذا البروتوكول ، يتم إجراء التقييم الخلوي قبل CM لتحديد المتلقين المحتملين. من المهم إجراء علم الخلايا قبل CM ، حيث يميل الإجراء إلى تفتيت الخلايا المقطوعة من منطقة المهبل ، مما يجعل التعرف عليها صعبا. يمكن إجراء التقييم الخلوي للحمل الكاذب أو الحمل في 3.5-11.5 يوما بعد CM (dpcm) لمدة 3 أيام متتالية. يجب أن يكون الملف الشخصي للإناث ركوب الدراجات الشهوقة على الأقل 1 يوم مع تسلل كبير للخلايا الظهارية المتقرنة. يجب أن تظهر الإناث الحوامل / الحوامل الزائفات ملف تعريف diestrus (في الغالب كريات الدم البيضاء مع عدد خلايا منخفض محتمل) لمدة 3 أيام متتالية.
من خلال تطوير تقنية CM ، وجد أن بعض الفئران أكثر تقبلا للإجراء من غيرها. تعتبر إناث الفئران CD1 مرشحة ممتازة بسبب طبيعتها الهادئة وغرائزها المغذية الممتازة. من السهل التعامل مع هذه السلالة وتعمل بشكل جيد أثناء تقنيات CM وتقنيات الإنجاب المساعدة غير الجراحية. تميل الفئران C57Bl / 6 إلى أن تكون أكثر عدوانية وأقل رعاية. في حين أن هذا البروتوكول أنتج بشكل فعال إناث C57Bl / 6 الحامل الزائف باستخدام CM ، إلا أنهن كن أقل عرضة للتساهل باستمرار مع الإجراء. يبدو أن هذا يرتبط إلى حد ما بالمرحلة الشحمية خلال CM. كانت الإناث في شبق أو شبق أكثر تقبلا. سمح استخدام أنبوب التخصيب للحيوان بالدخول إلى الوصول إلى المهبل لإجراء العملية وساعد على تهدئة الأنثى. الإجراء نفسه لا يقيد الأنثى تماما ، لذلك يمكن للحيوان الانسحاب في أي وقت. إذا حدث هذا ، يمكن إعادة وضع الحيوان ، ويمكن بعد ذلك متابعة الإجراء. يتوقف توقيت الإجراء إذا ابتعدت الأنثى واستأنفت عند استئناف الإجراء. من الأمور الحاسمة لنجاح الإجراء مرحلة الدورة الشحمية (الشبق المتأخر والشبق) واتصال القضيب بعنق الرحم. يوفر اهتزاز ماكينة القطع CM قياسية. لضمان ملامسة عنق الرحم ، يتم تطبيق ضغط لطيف على القضيب ، ويتم ضمان وضع القضيب مقابل عنق الرحم بحركات صغيرة ذهابا وإيابا للقضيب.
أدى استخدام CM إلى تحسين بروتوكول NSAI ، حيث يمكن اختيار الإناث في المرحلة الصحيحة من الدورة الشحمية قبل نقل الحيوانات المنوية ، ولم يعد البروتوكول مشروطا بالتزاوج مع الذكور الذين تم استئصال الأسهر. يتم توقيت تزامن دورة التلقيح الاصطناعي بحيث يتوافق نضوج البويضة مع نقل الحيوانات المنوية في صباح اليوم 4. من الأمور الحاسمة لنجاح البروتوكول تكييف توقيت الإباضة بحيث يمكن أن يحدث الإخصاب. يجب توخي الحذر لإدارة هرمون موجهة الغدد التناسلية المشيمائية البشرية 15-17 ساعة قبل النقل المتوقع للحيوانات المنوية ، كما هو مقترح للتوقيت المستخدم للتخصيب في المختبر 1. ستؤثر جودة عينة الحيوانات المنوية بشكل مباشر على نتيجة التلقيح الاصطناعي. الحيوانات المنوية الطازجة التي تم سعتها ستعمل بشكل أفضل. يمكن للحيوانات المنوية المحفوظة بالتبريد ذات النوعية الجيدة إنتاج أجنة مخصبة في الجسم الحي. ومع ذلك ، يجب توخي الحذر عند النقل المباشر للحيوانات المنوية المذابة ، لأن المواد الواقية بالتبريد المتبقية المنقولة إلى قرن الرحم قد تمنع الزرع (ملاحظات غير منشورة).
يعد استخدام CM جنبا إلى جنب مع نقل الأجنة تكيفا سهلا من الناحية المفاهيمية. يقلل تزامن الدورة Estrous من عدد الإناث اللازمة لإنتاج مجموعة المستلمين. تحديد المرحلة الشهوانية قبل CM يزيد من احتمال الحصول على المتلقين الحوامل الزائفة. عيب واحد من هذه الطريقة هو أن علم الخلايا من المتلقين في وقت نقل الأجنة هو في مرحلة من التغير. جميع أنواع الخلايا موجودة إذا كانت الأنثى تنتقل من شبق إلى ملف الحمل الكاذب ، ويصبح الحمل الكاذب واضحا فقط إذا تم تتبع علم الخلايا لعدة أيام. استنادا إلى نجاح (>80٪) في الانتقال من شبق إلى الحمل الكاذب للفئران CD1 و C57Bl / 6 ، من المتوقع أن تكون هذه الطريقة مناسبة لمتلقي نقل الأجنة. تظهر النتائج الأولية نجاحا جيدا مع نقل الأجنة غير الجراحي المحدود. بشكل عام ، فإن كفاءة نقل الأجنة غير الجراحية قابلة للمقارنة مع التقنية الجراحية 4,5 ، ويمكن أن يحل النقل غير الجراحي محل عمليات نقل الأجنة الجراحية في مرحلة الكيسة الأريمية. بالنسبة للأجنة في المراحل المبكرة ، يلزم زراعة الأجنة إلى مرحلة الكيسة الأريمية. ومع ذلك ، إذا كان النقل الجراحي مفضلا ، فمن الممكن تكييف تقنية CM مع التوقيت الصحيح اللازم للمتلقات الحوامل الزائفاتالمناسبات 2. بشكل عام ، فإن متلقي الجنين هم 1 يوم أقل تقدما من الجنين. على سبيل المثال ، يتم حصاد الكيسات الأريمية عند 3.5 dpc من المتبرعين ونقلها إلى 2.5 متلقي dpc. لذلك ، يجب إجراء CM بحيث يكون المتلقي في حالة حمل زائف أقل تطورا من الأجنة.
في الختام ، تظهر تقنية CM الموضحة هنا وعدا ممتازا للتكامل مع تقنيات الإنجاب المساعدة الأخرى للفئران. لقد قدمنا بروتوكولات ناجحة للتلقيح الاصطناعي ونقل الأجنة باستخدام تقنيات غير جراحية. مجتمعة ، توفر تقنية CM مزايا 3Rs ، بما في ذلك (1) تقليل عدد الحيوانات من خلال القضاء على الحاجة إلى الذكور الذين تم استئصال الأسهر و (2) تحسين التقنيات عن طريق استبدال التقنيات الجراحية ببدائل غير جراحية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم البحث المذكور في هذا المنشور من قبل مكتب مدير مكتب برامج البنية التحتية للبحوث ، التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم R43OD020304 والمعهد الوطني للصحة العقلية التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم R44MH122117. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Blastocyst stage embryos | |||
| CARD Fertiup Preincubation Medium (PM) | CosmoBio | KYD-002-EX | For sperm capacitation |
| Embryo handling pipette | Cook Medical | K-FPIP-1120-10BS | Flexipet is available in various diameters |
| Embryo handling pipette assembly | Paratechs | 90010 | |
| Female mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | Toothed, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | Curved, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 | Fine, for dissection |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | Optional |
| human Chorionic Gonadotropin (hCG) | Prospec | hor-250 | For estrus synchronization |
| Incubator, 37 °C 5% CO2 | Thermo Scientific | ||
| Incubator, 37 °C, benchtop | Cook | K-MINC-1000 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | Absorbant tissues |
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | Embryo handling medium |
| Male mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| mC&I device | ParaTechs | 60020 | For sperm transfer, specula included |
| mCM rod | ParaTechs | 90050 | Smooth, blunt, with a diameter @3 mm |
| Microscope | Olympus | SZX7 | 20x and 40x magnification with transmitted and reflected illumination source for embryo work and dissections |
| Microscope | ACCU-SCOPE | 3032 | 100x magnification with bright field illumination |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| mNSET device | ParaTechs | 60010 | For embryo transfer, specula included |
| Needles, 26 G | Exel | 26402 | |
| Papanicolaou Staining System | VWR | 76265-730 | Optional |
| Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 18512 | |
| Pipette, P200 | Corning | 4074 | Fits the C&I device for sperm transfer |
| Pipette, PR-2 | Rainin | 17008648 | Fits the NSET device for embryo transfer |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | Prospec | hor-272 | For estrus synchronization |
| Scale | American Weigh Scales | LB-1000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Dissection |
| Scissors | Fine Science Tools | 14081-09 | Angled, dissection |
| Swabs, Constix | Contec | SC-4 | For vaginal cytology |
| Syringes, 1 cc | Becton Dickenson and Company | 309659 | |
| Tissue culture dishes, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Tissue culture dishes, 60 mm | Falcon | 353004 | |
| Trimmer | Wahl | ChroMini T-Cut | |
| Wire bar topped mouse cage |
References
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. . Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, fourth edition. , (2014).
- Wake, Y., et al. Successful induction of pseudopregnancy using sonic vibration in mice. Scientific Reports. 13 (1), 3604 (2023).
- Stone, B. J., Steele, K. H., Fath-Goodin, A. A rapid and effective nonsurgical artificial insemination protocol using the NSET device for sperm transfer in mice without anesthesia. Transgenic Research. 24 (4), 775-781 (2015).
- Green, M., Bass, S., Spear, B. A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications. BioTechniques. 47 (5), 919-924 (2009).
- Bin Ali, R., et al. Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer. Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).
- Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro. Theriogenology. 151, 81-85 (2020).
- Stone, B. J., et al. A nonsurgical embryo transfer technique for fresh and cultured blastocysts in rats. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (5), 488-495 (2020).
- Steele, K. H., et al. Nonsurgical embryo transfer device compared with surgery for embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (1), 17-21 (2013).
- Terkel, J., Witcher, J. A., Adler, N. T. Evidence for "memory" of cervical stimulation for the promotion of pregnancy in rats. Hormones and Behavior. 24 (1), 40-49 (1990).
- Kaneko, T., Endo, M., Tsunoda, S., Nakagawa, Y., Abe, H. Simple induction of pseudopregnancy by artificial stimulation using a sonic vibration in rats. Scientific Reports. 10 (1), 2729 (2020).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), e35538 (2012).
- Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: Review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
- Luo, C., et al. Superovulation strategies for 6 commonly used mouse strains. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (4), 471-478 (2011).
- Gates, A. H. Viability and developmental capacity of eggs from immature mice treated with gonadotrophins. Nature. 177 (4512), 754-755 (1956).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
- Hasegawa, A., et al. Efficient and scheduled production of pseudopregnant female mice for embryo transfer by estrous cycle synchronization. Journal of Reproduction and Development. 63 (6), 539-545 (2017).
- Beaumont, H. M., Smith, A. F. Embryonic mortality during the pre- and post-implantation periods of pregnancy in mature mice after superovulation. Journal of Reproduction and Fertility. 45 (3), 437-448 (1975).
- Champlin, A. K., Dorr, D. L., Gates, A. H. Determining the stage of the estrous cycle in the mouse by the appearance of the vagina. Biology of Reproduction. 8 (4), 491-494 (1973).
