Induktion einer Pseudoschwangerschaft bei weiblichen Mäusen, ohne dass vasektomierte Männchen vor einem nicht-chirurgischen Embryotransfer oder einer künstlichen Befruchtung erforderlich sind
Summary
Die vorgestellte Methode zur Manipulation des Gebärmutterhalses kann bei Mäusen eine Pseudoschwangerschaft induzieren, ohne dass Weibchen mit vasektomierten Männchen verpaart werden müssen. Die Induktion einer Pseudoschwangerschaft ist Voraussetzung für den Erfolg des nicht-chirurgischen Embryotransfers und der nicht-chirurgischen künstlichen Befruchtung, die beide ebenfalls vorgestellt werden.
Abstract
Um die Schwangerschaft mit Embryotransfer oder künstlicher Befruchtung erfolgreich aufrechtzuerhalten, müssen weibliche Empfängermäuse in einen pseudoschwangeren Zustand versetzt werden. Weibliche Mäuse werden traditionell über Nacht mit vasektomierten Männchen gepaart und am nächsten Morgen wird das Vorhandensein eines Kopulationspfropfens beurteilt. Um die Effizienz der Produktion von pseudoschwangeren Weibchen zu erhöhen, wurde eine Technik zur Manipulation des Gebärmutterhalses standardisiert, die in Kombination mit nicht-chirurgischen Embryotransfer- oder künstlichen Befruchtungstechniken bei Mäusen eingesetzt werden kann. Das stumpfe Ende eines kleinen Plastikstäbchens wird vaginal eingeführt, um den Gebärmutterhals zu berühren, und wird durch Kontakt mit einem Trimmer 30 s lang in Schwingung versetzt. Das Verfahren ist schnell und erfordert keine Anästhesie oder Analgesie. Diese Technik erhöht die Zuverlässigkeit und Vorhersagbarkeit der Produktion von pseudoträchtigen Weibchen und eliminiert vollständig die Notwendigkeit von vasektomierten Männchen. Bei CD1-Mäusen betrug die Effizienz der Pseudoschwangerschaftsinduktion durch Manipulation des Gebärmutterhalses 83 % für Weibchen im Östrus (N = 76), aber nur 38 % der Weibchen im Östrus wurden durch vasektomierte Männchen verstopft (N = 24). Die künstliche Befruchtung bei CD1-Mäusen wurde durch Brunstsynchronisation mit Hormonen, Manipulation des Gebärmutterhalses und den Transfer von Spermien in die Gebärmutter durchgeführt. Künstliche Befruchtungsempfänger, die eine Gebärmutterhalsmanipulation erhielten (N = 76), hatten eine Trächtigkeitsrate von 72% und eine durchschnittliche Wurfgröße von 8,3 Welpen. Diese Methode kann auch verwendet werden, um pseudoschwangere Frauen für den nicht-chirurgischen Embryotransfer zu erzeugen. Daher ist die Induktion einer Pseudoschwangerschaft durch Manipulation des Gebärmutterhalses eine bequeme und effiziente Alternative zur Paarung mit einem vasektomierten Männchen, wenn nicht-chirurgische assistierte Reproduktionstechniken durchgeführt werden. Die Manipulation des Gebärmutterhalses bietet 3R-Vorteile (Ersatz, Reduktion und Verfeinerung) für Techniken der assistierten Reproduktion, indem sie die Anzahl der erforderlichen Tiere reduziert und die Notwendigkeit chirurgisch veränderter Männchen eliminiert.
Introduction
Technologien der assistierten Reproduktion werden für die Herstellung genetisch veränderter Mausmodelle sowie für die Rückgewinnung von Stämmen aus der Kryokonservierung, die Ableitung von Stämmen aus einem beeinträchtigten Gesundheitszustand und das strategische Vivariumsmanagement, einschließlich der Produktion altersgerechter Kohorten, eingesetzt. Alle Techniken der assistierten Reproduktion bei Mäusen erfordern den Einsatz von pseudoschwangeren Empfängerinnen für die Embryonalentwicklung. In der Vergangenheit wurden pseudoschwangere Empfängerinnen durch Paarung mit sterilen Männchen erzeugt, die entweder chirurgisch vasektomiert oder genetisch unfruchtbar sind, und das Vorhandensein eines Kopulationspfropfens wird am nächsten Morgen beurteilt1. Kürzlich wurde ein Protokoll für die akustische Stimulation in Mäusen für den chirurgischen Transfer von pronukleären oder zweizelligen Mausembryonen entwickelt2. Wir haben auch ein Protokoll zur Manipulation des Gebärmutterhalses (CM) für die künstliche Befruchtung und den nicht-chirurgischen Embryotransfer von Blastozysten entwickelt. Der Grund für die Anwendung des Verfahrens besteht darin, die Anzahl der benötigten Tiere um 3R zu reduzieren (keine männlichen Mäuse mehr erforderlich) und die verwendeten Techniken zu verfeinern (keine chirurgische Vasektomie mehr für männliche Mäuse erforderlich). Die Beschreibung dieses Protokolls beinhaltet die damit verbundene Technik der assistierten Reproduktion, um die Integration von CM in normale Arbeitsabläufe zu unterstützen. Das übergeordnete Ziel der CM-Methode ist es, die Verwendung männlicher Mäuse bei der Erzeugung pseudoschwangerer Weibchen für Techniken der assistierten Reproduktion, einschließlich künstlicher Befruchtung und Embryotransfer, zu ersetzen.
Das hier beschriebene CM-Protokoll wurde ursprünglich entwickelt, um die künstliche Befruchtung bei Mäusen zu unterstützen. Das ursprünglich beschriebene Protokoll der künstlichen Befruchtung erreichte eine Trächtigkeitsrate von 50 % bei einer durchschnittlichen Wurfgröße von 7 Welpen3. CD1-Empfängermäuse wurden in einem Intervall von 47 Stunden vor der Besamung mit einer niedrigen Dosis von Hormonen, einschließlich Serumgonadotropin (PMSG) und humanem Choriongonadotropin (hCG), mit einer niedrigen Dosis von Hormonen synchronisiert. Ein Vorteil der Brunstsynchronisation war, dass sie die Nutzung des Protokolls während der normalen Arbeitszeit ermöglichte. Die Weibchen wurden unmittelbar nach der künstlichen Befruchtung mit vasektomierten Männchen gepaart, und die Paarung wurde durch das Vorhandensein eines Kopulationspfropfens bestätigt. Inkonsistenz in der Paarungsrate mit Empfängern wurde als Schwierigkeit im Verfahren angegeben. Daher wurde nach Alternativen zur Paarung gesucht, um eine Pseudoschwangerschaft einzuleiten.
In der vorliegenden Studie wird eine standardisierte CM-Technik vorgestellt, um die Effizienz der Produktion von pseudoträchtigen Weibchen zu erhöhen. Bei Frauen in der Brunst oder im Proöstrus wird das stumpfe Ende eines kleinen Plastikstäbchens vaginal eingeführt, um den Gebärmutterhals zu berühren, und durch Kontakt mit einem Trimmer 30 s lang in Schwingung versetzt. Der Eingriff wird an einem drahtgebundenen Käfig durchgeführt. Es ist keine Anästhesie oder Analgesie erforderlich. Die CM-Technik eignet sich für die Produktion von pseudoträchtigen Weibchen, die nach einer nicht-chirurgischen künstlichen Befruchtung Würfe produzieren können, ohne dass eine Paarung mit vasektomierten Männchen erforderlich ist. CM kann auch für die Erzeugung von pseudoschwangeren Frauen als Empfängerinnen des Embryotransfers verwendet werden. Insbesondere kann die CM-Technik mit einem nicht-chirurgischen Embryotransfer kombiniert werden, wie hier beschrieben. Nicht-chirurgische Methoden haben sich für den Embryotransfer von Embryonen im Blastozystenstadium bei Mäusen 4,5und Ratten als wirksam erwiesen 6,7. Da diese nicht-chirurgische Methode eine effektive Alternative zu chirurgischen Methoden darstellt, gilt sie als 3R-Verfeinerung der Technik. Basierend auf früheren Forschungen deutet der fäkale Corticosteronspiegel als Maß für Stress darauf hin, dass der nicht-chirurgische Charakter des Verfahrens das Stressniveau bei Nagetieren nicht erhöht 7,8. Die Verfahren sind technisch weniger anspruchsvoll als der chirurgische Embryotransfer und viel schneller durchzuführen. Wenn die Embryonen in die Gebärmutter übertragen werden, müssen Embryonen im richtigen Stadium für die Entwicklung der Gebärmutter übertragen werden. Bei Mäusen werden Blastozysten 2,5 Tage nach dem Koitum (dpc) auf pseudoschwangere Empfängerinnen übertragen.
Bei den beiden hier beschriebenen nicht-chirurgischen Techniken unterscheidet sich der Zeitpunkt der Hormongabe und der CM-Technik. Der Zeitpunkt des CM-Eingriffs in Bezug auf die Brunst ist wichtig für den Erfolg, da er die natürliche Paarung für die Produktion von pseudoschwangeren Empfängerinnen ersetzt. Durch den Wegfall der Notwendigkeit von vasektomierten Männchen, eine Pseudoschwangerschaft herbeizuführen, bietet dieses Verfahren 3R-Vorteile, indem es sowohl die Anzahl der erforderlichen Tiere reduziert als auch die Notwendigkeit chirurgisch veränderter Männchen eliminiert. Der Eingriff selbst ist schnell (30 Sekunden) und erfordert keine Anästhesie oder Analgesie. Die Technik erhöht die Zuverlässigkeit und Vorhersagbarkeit der Produktion von pseudoträchtigen Weibchen für die assistierte Reproduktion erheblich.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die 3R sind ein ethischer Rahmen für die Verwendung von Tieren in der Forschung, wie er 1959 von Russel und Burch in “The Principles of Humane Experimental Technique”15 beschrieben wurde. Die 3R stehen für Ersatz, Reduzierung und Verfeinerung der Tiernutzung. Die hier hervorgehobenen Protokolle stimmen mit den 3R überein. Die Technik der Gebärmutterhalsmanipulation reduziert die Anzahl der benötigten Tiere, da keine Männchen mehr eingesetzt werden müssen, um pseudoträchtige Weibchen zu produzieren. Die Technik macht auch die Durchführung von Vasektomien bei den Männern überflüssig und sorgt so für Verfeinerung durch die Verringerung von Schmerzen und Leiden. Die hier beschriebenen Techniken der assistierten Reproduktion (künstliche Befruchtung und Embryotransfer) sind nicht-chirurgisch und bieten daher eine 3R-Verfeinerung, indem sie die Schmerzen und Leiden8reduzieren, die durch ihre chirurgischen Alternativen verursacht werden.
Die Verwendung von pseudoträchtigen Weibchen ist für die Genesung von Jungtieren bei der Durchführung der assistierten Reproduktion bei Mäusen erforderlich1. Das CM-Verfahren ist eine effektive Methode zur Erzeugung pseudoschwangerer Weibchen, aber die Synchronisierung der Phase des Brunstzyklus der Empfängerweibchen ist ein kritischer erster Schritt in diesem Prozess. Die Brunstsynchronisation kann die Anzahl der Weibchen, die in der Kolonie benötigt werden, um potenzielle Empfänger vorzubereiten, drastisch reduzieren und hilft bei der zeitgesteuerten Produktion von pseudoträchtigen Weibchen auf Abruf. Die Verwendung einer niedrigen Hormondosis scheint bei CD1-Mäusen keine schädlichen Auswirkungen auf die Erholung lebender Würfe zu haben. Bei anderen Stämmen muss darauf geachtet werden, die Hormon- und Konzentrationskombination zu finden, die die besten Empfängerfrauen für die übertragenen Embryonen oder Spermien hervorbringt. Die Synchronisierung kann mit PMSG und hCG16 erreicht werden, aber Dosen, die zu superovulierten Frauen führen, sind möglicherweise nicht für eine anhaltende Schwangerschaft geeignet17.
Um festzustellen, ob sich ein Weibchen im Östrus befindet, wurde in dieser Arbeit eine zytologische Untersuchung durchgeführt. Die Östrusphase kann auch durch die Beobachtung der Vaginalöffnung11,18 beurteilt werden. Diese Methode ist zwar äußerst hilfreich und kann allein oder als Bestätigung verwendet werden, ist aber subjektiver als die Anwendung der Zytologie. Die vaginale Zytologie ohne Färbung ist sowohl schnell als auch effektiv für die Auswahl von Frauen in der Brunst, da verhornte Epithelzellen leicht identifiziert werden können. In diesem Protokoll wird die zytologische Untersuchung vor der CM durchgeführt, um potenzielle Empfänger zu bestimmen. Es ist wichtig, vor der CM eine Zytologie durchzuführen, da das Verfahren dazu neigt, die aus dem Vaginalbereich abgelösten Zellen zu fragmentieren, was die Identifizierung erschwert. Die zytologische Untersuchung auf Pseudoschwangerschaft oder Schwangerschaft kann 3,5-11,5 Tage nach der CM (dpcm) an 3 aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt werden. Das Profil eines östros Cycling-Weibchens sollte mindestens 1 Tag mit erheblicher Infiltration von verhornten Epithelzellen aufweisen. Pseudoschwangere/trächtige Weibchen sollten an 3 aufeinanderfolgenden Tagen ein Diestrusprofil (meist Leukozyten mit potenziell niedriger Zellzahl) aufweisen.
Durch die Entwicklung der CM-Technik wurde festgestellt, dass einige Mäuse empfänglicher für das Verfahren sind als andere. CD1-Mäuse sind aufgrund ihres ruhigen Wesens und ihres ausgezeichneten Fürsorgeinstinkts ausgezeichnete Kandidaten. Diese Sorte ist einfach zu handhaben und eignet sich gut für die CM und nicht-chirurgische assistierte Reproduktionstechniken. C57Bl/6-Mäuse neigen dazu, aggressiver und weniger fürsorglich zu sein. Während dieses Protokoll effektiv pseudoschwangere C57Bl/6-Weibchen mit CM produzierte, war es weniger wahrscheinlich, dass sie das Verfahren konsequent akzeptierten. Dies schien in gewisser Weise mit der Brunstphase während der CM zu korrelieren. Frauen in Östrus oder Proöstrus waren empfänglicher. Die Verwendung eines Anreicherungsschlauchs, in den das Tier eindringen konnte, ermöglichte den Zugang zur Vagina für den Eingriff und half, das Weibchen zu beruhigen. Der Eingriff selbst hält das Weibchen nicht vollständig zurück, so dass sich das Tier jederzeit zurückziehen kann. In diesem Fall kann das Tier umgelagert und die Prozedur fortgesetzt werden. Der Zeitpunkt des Eingriffs stoppt, wenn das Weibchen weggeht, und setzt ihn fort, wenn der Eingriff wieder aufgenommen wird. Entscheidend für den Erfolg des Eingriffs sind die Phase des Brunstzyklus (späte Proöstrus und Östrus) und der Kontakt des Stäbchens mit dem Gebärmutterhals. Die Vibration des Trimmers sorgt für eine standardisierte CM. Um den Kontakt mit dem Gebärmutterhals zu gewährleisten, wird sanfter Druck auf den Stab ausgeübt und die Positionierung des Stabes am Gebärmutterhals durch kleine Hin- und Herbewegungen des Stabes sichergestellt.
Die Verwendung von CM hat das NSAI-Protokoll verbessert, da Weibchen in der richtigen Phase des Brunstzyklus vor dem Spermientransfer ausgewählt werden können und das Protokoll nicht mehr von der Paarung mit vasektomierten Männchen abhängt. Die Synchronisierung des Östruszyklus der künstlichen Befruchtung ist so getaktet, dass die Reifung der Eizellen dem Spermientransfer am Morgen des 4. Tages entspricht. Entscheidend für den Erfolg des Protokolls ist die Anpassung des Zeitpunkts des Eisprungs, damit eine Befruchtung stattfinden kann. Es muss darauf geachtet werden, hCG 15-17 Stunden vor dem erwarteten Spermientransfer zu verabreichen, wie es für die für die In-vitro-Fertilisation verwendeten Zeitpunkte vorgeschlagen wird1. Die Qualität der Samenprobe wirkt sich direkt auf das Ergebnis der künstlichen Befruchtung aus. Frische Spermien, die kapazitiv sind, werden die beste Leistung erbringen. Kryokonservierte Spermien von guter Qualität können in vivo befruchtete Embryonen hervorbringen. Bei der direkten Übertragung von aufgetauten Spermien ist jedoch Vorsicht geboten, da verbleibende Kryoprotektoren, die auf das Gebärmutterhorn übertragen werden, die Einnistung hemmen können (unveröffentlichte Beobachtungen).
Die Verwendung von CM in Verbindung mit dem Embryotransfer ist konzeptionell eine einfache Anpassung. Die Synchronisierung des Brunstzyklus reduziert die Anzahl der Weibchen, die für die Produktion des Empfängerpools erforderlich sind. Die Bestimmung des Östrusstadiums vor CM erhöht die Wahrscheinlichkeit, pseudoschwangere Empfängerinnen zu erhalten. Ein Nachteil der Methode ist, dass sich die Zytologie der Empfängerinnen zum Zeitpunkt des Embryotransfers in einem Stadium des Wandels befindet. Alle Zelltypen sind vorhanden, wenn das Weibchen vom Brunst- in das Pseudoschwangerschaftsprofil übergeht, und eine Pseudoschwangerschaft wird nur offensichtlich, wenn die Zytologie über mehrere Tage verfolgt wird. Basierend auf dem Erfolg (>80%) des Übergangs von der Brunst zur Pseudoschwangerschaft bei CD1- und C57Bl/6-Mäusen wird erwartet, dass diese Methode für Empfängerinnen des Embryotransfers geeignet ist. Die vorläufigen Ergebnisse zeigen gute Erfolge bei begrenztem nicht-chirurgischem Embryotransfer. Im Allgemeinen ist die Effizienz des nicht-chirurgischen Embryotransfers mit der der chirurgischen Technikvergleichbar 4,5, und der nicht-chirurgische Transfer kann den chirurgischen Embryotransfer im Blastozystenstadium ersetzen. Für Embryonen im Frühstadium ist eine Embryokultur bis zum Blastozystenstadium erforderlich. Wenn jedoch ein chirurgischer Transfer bevorzugt wird, ist es möglich, die CM-Technik an das richtige Timing anzupassen, das für geeignete pseudoschwangere Empfängerinnen erforderlich ist2. Im Allgemeinen sind die Embryonenempfänger 1 Tag weniger fortgeschritten als der Embryo. Zum Beispiel werden Blastozysten mit 3,5 dpc von Spendern entnommen und an 2,5 dpc-Empfänger übertragen. Daher muss die CM so durchgeführt werden, dass sich die Empfängerin in einem weniger entwickelten pseudoschwangeren Zustand befindet als die Embryonen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier beschriebene CM-Technik ein hervorragendes Potenzial für die Integration mit anderen Techniken der assistierten Reproduktion bei Mäusen darstellt. Wir haben erfolgreiche Protokolle für die künstliche Befruchtung und den Embryotransfer mit nicht-chirurgischen Techniken bereitgestellt. In Kombination bietet die CM-Technik 3R-Vorteile, darunter (1) eine Reduzierung der Anzahl der Tiere durch den Wegfall der Notwendigkeit von vasektomierten Männchen und (2) eine Verfeinerung der Techniken durch den Ersatz chirurgischer Techniken durch nicht-chirurgische Alternativen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die in dieser Veröffentlichung vorgestellte Forschung wurde vom Büro des Direktors, Office of Research Infrastructure Programs, der National Institutes of Health unter der Award-Nummer R43OD020304 und des National Institute of Mental Health der National Institutes of Health unter der Award-Nummer R44MH122117 unterstützt. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar.
Materials
| Blastocyst stage embryos | |||
| CARD Fertiup Preincubation Medium (PM) | CosmoBio | KYD-002-EX | For sperm capacitation |
| Embryo handling pipette | Cook Medical | K-FPIP-1120-10BS | Flexipet is available in various diameters |
| Embryo handling pipette assembly | Paratechs | 90010 | |
| Female mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | Toothed, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | Curved, for dissection |
| Forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 | Fine, for dissection |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | Optional |
| human Chorionic Gonadotropin (hCG) | Prospec | hor-250 | For estrus synchronization |
| Incubator, 37 °C 5% CO2 | Thermo Scientific | ||
| Incubator, 37 °C, benchtop | Cook | K-MINC-1000 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | Absorbant tissues |
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | Embryo handling medium |
| Male mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
| mC&I device | ParaTechs | 60020 | For sperm transfer, specula included |
| mCM rod | ParaTechs | 90050 | Smooth, blunt, with a diameter @3 mm |
| Microscope | Olympus | SZX7 | 20x and 40x magnification with transmitted and reflected illumination source for embryo work and dissections |
| Microscope | ACCU-SCOPE | 3032 | 100x magnification with bright field illumination |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| mNSET device | ParaTechs | 60010 | For embryo transfer, specula included |
| Needles, 26 G | Exel | 26402 | |
| Papanicolaou Staining System | VWR | 76265-730 | Optional |
| Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 18512 | |
| Pipette, P200 | Corning | 4074 | Fits the C&I device for sperm transfer |
| Pipette, PR-2 | Rainin | 17008648 | Fits the NSET device for embryo transfer |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | Prospec | hor-272 | For estrus synchronization |
| Scale | American Weigh Scales | LB-1000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Dissection |
| Scissors | Fine Science Tools | 14081-09 | Angled, dissection |
| Swabs, Constix | Contec | SC-4 | For vaginal cytology |
| Syringes, 1 cc | Becton Dickenson and Company | 309659 | |
| Tissue culture dishes, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Tissue culture dishes, 60 mm | Falcon | 353004 | |
| Trimmer | Wahl | ChroMini T-Cut | |
| Wire bar topped mouse cage |
References
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. . Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, fourth edition. , (2014).
- Wake, Y., et al. Successful induction of pseudopregnancy using sonic vibration in mice. Scientific Reports. 13 (1), 3604 (2023).
- Stone, B. J., Steele, K. H., Fath-Goodin, A. A rapid and effective nonsurgical artificial insemination protocol using the NSET device for sperm transfer in mice without anesthesia. Transgenic Research. 24 (4), 775-781 (2015).
- Green, M., Bass, S., Spear, B. A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications. BioTechniques. 47 (5), 919-924 (2009).
- Bin Ali, R., et al. Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer. Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).
- Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro. Theriogenology. 151, 81-85 (2020).
- Stone, B. J., et al. A nonsurgical embryo transfer technique for fresh and cultured blastocysts in rats. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (5), 488-495 (2020).
- Steele, K. H., et al. Nonsurgical embryo transfer device compared with surgery for embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (1), 17-21 (2013).
- Terkel, J., Witcher, J. A., Adler, N. T. Evidence for "memory" of cervical stimulation for the promotion of pregnancy in rats. Hormones and Behavior. 24 (1), 40-49 (1990).
- Kaneko, T., Endo, M., Tsunoda, S., Nakagawa, Y., Abe, H. Simple induction of pseudopregnancy by artificial stimulation using a sonic vibration in rats. Scientific Reports. 10 (1), 2729 (2020).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), e35538 (2012).
- Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: Review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
- Luo, C., et al. Superovulation strategies for 6 commonly used mouse strains. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (4), 471-478 (2011).
- Gates, A. H. Viability and developmental capacity of eggs from immature mice treated with gonadotrophins. Nature. 177 (4512), 754-755 (1956).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
- Hasegawa, A., et al. Efficient and scheduled production of pseudopregnant female mice for embryo transfer by estrous cycle synchronization. Journal of Reproduction and Development. 63 (6), 539-545 (2017).
- Beaumont, H. M., Smith, A. F. Embryonic mortality during the pre- and post-implantation periods of pregnancy in mature mice after superovulation. Journal of Reproduction and Fertility. 45 (3), 437-448 (1975).
- Champlin, A. K., Dorr, D. L., Gates, A. H. Determining the stage of the estrous cycle in the mouse by the appearance of the vagina. Biology of Reproduction. 8 (4), 491-494 (1973).
