非外科的胚移植または人工授精の前に精管切除された雄を必要とせずに雌マウスに偽妊娠を誘導する

動物の世話と使用に関して適用されるすべての国際的、国内的、および制度的ガイドラインが守られました。動物を対象とした研究で実施されたすべての手順は、ParaTechs Corporationの施設動物管理および使用委員会の倫理基準に準拠し、米国保健社会福祉省の国立衛生研究所、公衆衛生サービス、実験動物福祉局によって定められた基準に基づいて実施されました。本研究では、>8週齢の雄および雌のCD1(ICR)および雌のC57Bl / 6Jマウスを使用しました。動物は商業的な情報源から入手した( 材料表を参照)。 1. CD1マウスの人工授精に用いる子宮頸部操作法 1日目と3日目の雌マウスの同期排卵雌マウスに2.5IU PMSG( 材料の表を参照)を腹腔内注射(IP)で1日目、ビバリウム暗サイクルの開始の0.5時間前に注射します。注:各男性ドナーは、10人の女性レシピエントに十分な精子を提供します。 ビバリウム暗サイクルの開始の1時間前の3日目にIP注射によって2.5IU hCG( 材料表を参照)を雌に注射する。注:注射、精子の移動、および互いの光サイクルのタイミングは非常に重要です。このプロトコルのすべての手順に指定された時間は、12時間の明暗サイクルに基づいています。 4日目の新鮮な精子の収集と容量化500 μL滴の精子プレインキュベーション培地(PM、 材料の表を参照)をパラフィンオイル下の60 mm組織培養皿に調製します。男性のドナーごとに1つの料理を準備します。精子採取前に37°Cおよび5%CO2 で少なくとも30分間平衡化する。 ビバリウムライトサイクルの開始から1時間後に、施設のガイドラインに従って男性を安楽死させます。各男性は10回の人工授精に十分な精子を提供します。 マウスから精巣上体尾を素早く解剖する。解剖ハサミと歯付き鉗子を使用して、膀胱の上に横方向の腹部切開を行います。精巣脂肪パッドは膀胱の両側にあります。湾曲した鉗子で精巣脂肪パッドの1つをつかみ、体腔から精巣と精巣上体を取り除きます。精巣上体尾を精巣のすぐ下の平らな楕円形の管状構造として識別します。 湾曲した鉗子で精巣尾を持ち、小さな角度の付いたはさみを使用して切除します。両方の精巣上体尾を除去し、それらを吸収組織に移して、解剖顕微鏡下で脂肪と血液を除去します。 2つの精巣上体尾を37°Cのパラフィンオイル下で平衡化PMの各500μL滴に入れます。小さなハサミを使って6つの切開をして組織を切り取ります。複数の男性ドナーを使用する場合は、精子サンプルごとに各ドナーから1つの精巣上体を使用して、サンプル間のばらつきを減らします。 皿をそっと回転させ、精子が3分間組織から出るようにし、1分間に1回旋回させます。すべての組織を取り除きます。 精子サンプルを37°Cおよび5%CO2 で45分〜1時間インキュベートして容量化する。 オプション:精子数を測定し、血球計算盤を使用して顕微鏡下で運動性を評価します。カウントするには、必要に応じて精子をPMで希釈します。 細胞学的評価による発情周期同期の確認あらかじめ湿らせた小さな綿棒(材料表を参照)を使用して、綿棒を組織に押し付けて膣壁から膣細胞をそっと集め、顕微鏡スライド上で20 μLの滅菌水滴に塗りつけ、風乾します。 明視野照明による100倍の倍率を用いた顕微鏡下で、角化上皮細胞の存在を評価します。発情期または発情期後期の女性は、角質化した上皮細胞が存在し、子宮頸部操作のために選択する必要があります。 オプション:授精前に女性のレシピエントの体重を記録します。 頸部マニピュレーション(CM)の実行授精の約0.5時間前に、レシピエントの女性をワイヤーラック付きのケージの上に置き、マウスがケージバーの表面を「つかむ」ことができるようにします。親指と人差し指で尾の付け根近くをつかみ、動物を安定させながら尾を上に傾けます(図1)。注意: 操作手順が正しく実行されると、マウスは手順の間静止したままになります。マウスの位置がずれた場合は、ゆっくりと位置を変えて続行します。攻撃的な動物がレシピエントとして選択された場合、手順中に動物が濃縮トンネルに足を踏み入れることを許可することは落ち着くことができます。トンネルの使用はオプションですが、この手順中に気を散らすことで、研究者が動物を扱うのに役立ちます。 小さなプラスチック棒(材料表を参照)の鈍い端を膣に挿入して子宮頸部に接触させ、トリマーと接触させて30秒間振動させます( 材料表を参照)。注意: トリマーを開始する前に、ロッドを所定の位置に配置してください。処置中は両方とも片手で保持されます。麻酔や鎮痛は必要ありません。 人工授精のための非外科的精子移植授精装置(材料表を参照)を40μLに設定したP200ピペットに置き、保護カバーを取り外します。 容量入り精子サンプルのアリコートを37°C、5%CO2でディッシュから取り出し、37°Cで油を含まない35mm組織培養ディッシュに移します。 精子サンプルはすぐに転送に使用されます。注:精子はCO2 インキュベーターの外で急速に運動性を失います。容量化された精子サンプルを可能な限り37°Cおよび5%CO2 に保ちます。 ピペットプランジャーを最初の停止まで押し、カテーテルチップを37°Cで精子サンプルに下げ、精子をゆっくりと移送装置にロードします。塊を避けてください。吸収性組織を使用して、授精装置の外側から残留油を取り除きます。ピペットを脇に置きます。注:子宮角へのパラフィンオイルの移動は避けなければなりません。吸収性組織を使用して、授精装置の外側から残留油を取り除きます。 受信者の女性をワイヤーラックケージの上部に置きます。CMで使用されているのと同じ処理手法を使用して、マウスを所定の位置に保持します。親指と人差し指で尾の付け根近くをつかみ、動物を安定させながら尾を上に傾けます。 小さな検鏡( 材料表を参照)を膣に入れます。 授精装置カテーテルを検鏡、子宮頸部、子宮に挿入します。デバイスハブが検鏡に接触したら、ピペットプランジャーを最初の停止まで押して精子を分注します。子宮角への余分な空気の移動を避けてください。注意: カテーテルが正しく配置されていないと、子宮頸部の周囲の組織に当たり、カテーテルが曲がり、最終的には曲がります。最初の試行でカテーテルが子宮頸部を滑らない場合は、カテーテルをそっと戻し、成功するまで再試行します。検鏡の再配置が必要な場合があります。 デバイスと検鏡を取り外します。処置後のモニタリングは必要ありません。 オプション:10〜12日目の妊娠チェック体重増加を使用して妊娠状態を判断します。体重増加は緊張に依存しますが、少なくとも1〜2 gの増加は妊娠と相関します。 図1:頸部操作のためのマウス保持技術。 マウスはワイヤーケージの上部に置かれ、尾と後ろ足の前部の両側で安定しています。小さなプラスチック棒の鈍い端を膣に挿入して子宮頸部に接触させ、トリマーとの接触によって振動させます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 2. CD1マウスの子宮頸部マニピュレーションに用いる非外科的胚移植法 1日目と3日目の雌マウスの同期排卵雌マウスにIP注射により2.5IU PMSGを注射し、ビバリウム光サイクルの開始から約6時間後。 PMSG注射後47時間間隔またはビバリウム光サイクルの開始後約5時間間隔で、3日目にIP注射によって2.5IU hCGを雌に注射する。 細胞学的評価による発情周期の同期の確認CMの約1時間前の3日目に、潜在的なレシピエントの細胞診を行います。あらかじめ湿らせた小さな綿棒を使用して、綿棒を組織に押し付けて膣壁から膣細胞をそっと集め、顕微鏡スライド上で20 μLの滅菌水滴に塗りつけ、風乾します。 明視野照明による100倍の倍率を用いた顕微鏡下で、角化上皮細胞の存在を評価します。発情期または発情期後期の女性は、角質化した上皮細胞が存在し、子宮頸部操作のために選択する必要があります。 オプション:潜在的な女性胚レシピエントの体重を記録します。 CMの実行ビバリウムダークサイクルの開始の1時間前の3日目に、レシピエントのメスをワイヤーラック付きのケージの上に置き、動物がケージバーの表面を「つかむ」ことができるようにします。人差し指と親指で尾の付け根付近をつかみ、動物を安定させながら尾を上に傾けます(図1)。注意: 操作手順が正しく実行されると、マウスは手順の間静止したままになります。マウスの位置がずれた場合は、ゆっくりと位置を変えて続行します。攻撃的な動物がレシピエントとして選択された場合、手順中に動物が濃縮トンネルに足を踏み入れることを許可することは落ち着くことができます。 小さなプラスチック棒の鈍い端を膣に挿入して子宮頸部に接触させ、トリマーと接触させて30秒間振動させます。注意: トリマーを開始する前に、ロッドを所定の位置に配置してください。処置中は両方とも片手で保持されます。麻酔や鎮痛は必要ありません。 6日目の非外科的胚移植20 μLのM2培地( 材料表を参照)を組織培養皿の蓋の上に置きます。注:蓋は縁が短いため、ドロップ内の胚にアクセスするのに便利です。子宮角に油を導入すると胚移植に悪影響を与えるように見えるため、M2の低下の上にパラフィン油を重ねないでください。 顕微鏡下で反射照明を使用して、標準的な胚処理ピペットを使用して、10〜20個の胚盤胞を培地滴にロードします(材料表を参照)。注:移植する胚の最適な数は、マウスの系統と胚が受けた操作によって異なります。健康な未操作の胚の場合、10〜15個の胚を移植すれば十分です。再誘導または遺伝子組み換え胚の場合、より多くの胚の移植が適切です。 非外科的胚移植装置(材料表を参照)を1.8 μLにセットしたP2ピペットに固定します。 保護カテーテルカバーを取り外します。 ピペットのプランジャーを最初の停止まで押し、カテーテルの先端を培地に下げ、胚をデバイスのカテーテル先端にゆっくりと引き込みます。メディアからチップを取り外します。注:低倍率で胚を視覚化すると、胚をデバイスに簡単にロードできます。胚が滴の中に散らばっている場合は、皿を左右に静かに振って胚を滴の中央に集中させるか、胚処理ピペットを使用して胚の位置を変えます。 ピペット容量を2.0μLに設定して、カテーテルの先端に小さな気泡を発生させます。マウスケージの近くに胚をロードした状態でピペットを静かに置きます。 受信者の女性をワイヤーラックケージの上部に置きます。CMで使用したのと同じ処理方法を使用して、マウスを所定の位置に保持します。人差し指と親指で尻尾の付け根付近をつかみ、動物を安定させながら尻尾を上に傾けます。 小さな検鏡( 材料表を参照)を膣に入れます。 移送装置カテーテルを検鏡、子宮頸部、子宮に挿入します。デバイスハブが検鏡に接触したら、ピペットプランジャーを最初の停止まで押して胚を分注します。子宮角への余分な空気の移動を避けてください。 ピペットプランジャーを離さずに、デバイスと検鏡を取り外します。処置後のモニタリングは必要ありません。