シングルセル分解能でのエピゲノムおよび遺伝子発現プロファイリングのためのマウス心臓前駆細胞からの核分離(英語)

先天性欠損症の中で、先天性心疾患(CHD)が最も一般的であり、毎年出生の約1%で発生します^1,2。遺伝子変異は少数の症例でしか特定されておらず、遺伝子調節の異常などの他の原因がCHD ^2,3の病因に関与していることを意味します。心臓の発生は、多様で相互作用する細胞型の複雑なプロセスであり、原因となる非コード変異と遺伝子制御への影響を特定することは困難です。心臓の器官形成は、心筋細胞、線維芽細胞、心外膜細胞、心内膜細胞など、さまざまなサブタイプの心臓細胞を生じさせる細胞前駆細胞から始まります^4,5。シングルセルゲノミクスは、心臓の発達を研究し、健康と病気における細胞の不均一性の影響を評価するための重要な方法として浮上しています⁶。異なるパラメータの同時測定のためのマルチオミクス法の開発と計算パイプラインの拡大により、正常および病気の心臓における細胞タイプとサブタイプの発見が容易になりました⁶。本稿では、マウス胚から得られた凍結心臓前駆細胞について、下流のsnRNA-seqおよびsnATAC-seq(およびsnRNA-seqとsnATAC-seqの組み合わせ)と互換性のある信頼性の高い単核単細胞分離プロトコルについて説明します^7,8,9。

ATAC-seqは、調節オープンクロマチン領域の同定とヌクレオソームの位置決めを可能にする堅牢な方法です^10,11。この情報は、転写因子の位置、同一性、および活性に関する結論を引き出すために使用されます。リモデリング剤を含むクロマチン因子の活性、およびRNAポリメラーゼの転写活性は、クロマチン構造の定量的変化を測定するのに非常に感度が高いため、分析することができます^1,2。したがって、ATAC-seqは、特定の細胞型における転写調節を制御するメカニズムを明らかにするための堅牢で公平なアプローチを提供します。ATAC-seqプロトコルは、単一細胞におけるクロマチンアクセシビリティを測定するためにも検証されており、細胞集団内のクロマチン構造のばらつきを明らかにしています¹⁰、^12、13。

近年、単一細胞の分野で顕著な進歩がありましたが、主な困難は、これらの実験を実行するために必要な新鮮なサンプルの処理です¹⁴。この困難を回避するために、凍結心臓組織または細胞を用いてsnRNA-seqおよびsnATAC-seqなどの分析を行うことを目的として様々な試験が実施されてきた^15,16。

シングルセルゲノミクスデータを解析するために、いくつかのプラットフォームが使用されてきた¹⁷。単一細胞遺伝子発現およびATACプロファイリングに広く使用されているプラットフォームは、複数のマイクロ流体液滴カプセル化のためのプラットフォームです¹⁷。これらのプラットフォームはマイクロ流体チャンバーを使用しているため、破片や凝集物がシステムを詰まらせ、データが使用できなくなる可能性があります。したがって、単一細胞研究の成功は、個々の細胞/核の正確な分離にかかっています。

ここで紹介するプロトコルは、snRNA-seqおよびsnATAC-seqを使用した最近の研究と同様のアプローチを使用して、先天性心疾患を理解しています¹⁸、^19、20、21、^22、23。この手順では、新たにマイクロ解剖された心臓組織の酵素解離とそれに続くマウス心臓前駆細胞の凍結保存を利用します。解凍後、生細胞は精製され、核分離のために処理されます。この研究では、このプロトコルを使用して、マウス心臓前駆細胞の同じ核製剤からsnRNA-seqおよびsnATAC-seqデータを取得することに成功しました。