Isolamento di nuclei da cellule progenitrici cardiache di topo per il profilo dell'epigenoma e dell'espressione genica a risoluzione di singole cellule

Tra i difetti alla nascita, i difetti cardiaci congeniti (CHD) sono i più comuni, che si verificano in circa l’1% dei nati vivi ogni anno ^1,2. Le mutazioni genetiche sono identificate solo in una minoranza di casi, il che implica che altre cause, come anomalie nella regolazione genica, sono coinvolte nell’eziologia della CHD ^2,3. Lo sviluppo cardiaco è un processo complesso di tipi cellulari diversi e interagenti, che rende difficile l’identificazione delle mutazioni causali non codificanti e dei loro effetti sulla regolazione genica. L’organogenesi del cuore inizia con progenitori cellulari che danno origine a diversi sottotipi di cellule cardiache, tra cui cellule miocardiche, fibroblasti, epicardiche ed endocardiche ^4,5. La genomica unicellulare sta emergendo come metodo chiave per studiare lo sviluppo del cuore e valutare l’impatto dell’eterogeneità cellulare nella salute e nella malattia⁶. Lo sviluppo di metodi multi-omici per la misurazione simultanea di diversi parametri e l’espansione di pipeline computazionali ha facilitato la scoperta di tipi e sottotipi cellulari nel cuore normale e malato⁶. Questo articolo descrive un protocollo affidabile di isolamento a singolo nucleo per cellule progenitrici cardiache congelate ottenute da embrioni di topo che è compatibile con snRNA-seq e snATAC-seq a valle (così come snRNA-seq e snATAC-seq combinati)^7,8,9.

ATAC-seq è un metodo robusto che consente l’identificazione delle regioni regolatorie della cromatina aperta e il posizionamento dei nucleosomi^10,11. Queste informazioni vengono utilizzate per trarre conclusioni sulla posizione, l’identità e l’attività dei fattori di trascrizione. L’attività dei fattori cromatinici, compresi i rimodellatori, così come l’attività trascrizionale della RNA polimerasi, possono quindi essere analizzate poiché il metodo è altamente sensibile per misurare i cambiamenti quantitativi nella struttura della cromatina ^1,2. Pertanto, ATAC-seq fornisce un approccio robusto e imparziale per scoprire i meccanismi che controllano la regolazione trascrizionale in un tipo specifico di cellula. I protocolli ATAC-seq sono stati anche validati per misurare l’accessibilità della cromatina in singole cellule, rivelando variabilità nell’architettura della cromatina all’interno delle popolazioni cellulari^10,12,13.

Sebbene negli ultimi anni vi siano stati notevoli progressi nel campo delle singole cellule, la difficoltà principale è l’elaborazione dei campioni freschi necessari per eseguire questi esperimenti¹⁴. Per aggirare questa difficoltà, sono stati effettuati vari test con l’obiettivo di condurre analisi come snRNA-seq e snATAC-seq con tessuto cardiaco congelato o cellule^15,16.

Diverse piattaforme sono state utilizzate per analizzare i dati genomici di singole cellule¹⁷. Le piattaforme ampiamente utilizzate per l’espressione genica di singole cellule e il profilo ATAC sono piattaforme per l’incapsulamento multiplo di goccioline microfluidiche¹⁷. Poiché queste piattaforme utilizzano camere microfluidiche, detriti o aggregati possono ostruire il sistema, con conseguente inutilizzabilità dei dati. Pertanto, il successo degli studi su singole cellule dipende dall’isolamento accurato delle singole cellule / nuclei.

Il protocollo qui presentato utilizza un approccio simile a studi recenti che utilizzano snRNA-seq e snATAC-seq per comprendere i difetti cardiaci congeniti 18,19,20,21,22,23. Questa procedura utilizza la dissociazione enzimatica del tessuto cardiaco appena microdissecato seguito dalla crioconservazione delle cellule progenitrici cardiache di topo. Dopo lo scongelamento, le cellule vitali vengono purificate e lavorate per l’isolamento nucleare. In questo lavoro, questo protocollo è stato utilizzato con successo per ottenere dati snRNA-seq e snATAC-seq dalla stessa preparazione nucleare di cellule progenitrici cardiache di topo.