Aislamiento de núcleos de células progenitoras cardíacas de ratón para epigenoma y perfil de expresión génica a resolución de una sola célula
Summary
Aquí, presentamos un protocolo que describe la preparación de los núcleos celulares. Después de la microdisección y la disociación enzimática del tejido cardíaco en células individuales, las células progenitoras se congelaron, seguidas del aislamiento de células viables puras, que se utilizaron para la secuenciación de ARN de un solo núcleo y el ensayo de núcleo único para la cromatina accesible a transposasa con análisis de secuenciación de alto rendimiento.
Abstract
El corazón en desarrollo es una estructura compleja que contiene varias células progenitoras controladas por mecanismos reguladores complejos. El examen de la expresión génica y el estado de cromatina de las células individuales permite la identificación del tipo y estado celular. Los enfoques de secuenciación de células individuales han revelado una serie de características importantes de la heterogeneidad de las células progenitoras cardíacas. Sin embargo, estos métodos generalmente están restringidos al tejido fresco, lo que limita los estudios con diversas condiciones experimentales, ya que el tejido fresco debe procesarse de inmediato en la misma ejecución para reducir la variabilidad técnica. Por lo tanto, se necesitan procedimientos fáciles y flexibles para producir datos de métodos como la secuenciación de ARN de núcleo único (snRNA-seq) y el ensayo de núcleo único para la cromatina accesible a transposasa con secuenciación de alto rendimiento (snATAC-seq) en esta área. Aquí, presentamos un protocolo para aislar rápidamente núcleos para posteriores dualómicas de núcleos únicos (snRNA-seq y snATAC-seq combinados). Este método permite el aislamiento de núcleos a partir de muestras congeladas de células progenitoras cardíacas y puede combinarse con plataformas que utilizan cámaras microfluídicas.
Introduction
Entre los defectos congénitos, los defectos cardíacos congénitos (CHD) son los más comunes, que ocurren en aproximadamente el 1% de los nacidos vivos cada año 1,2. Las mutaciones genéticas se identifican sólo en una minoría de casos, lo que implica que otras causas, como las anomalías en la regulación génica, están implicadas en la etiología de la cardiopatía coronaria 2,3. El desarrollo cardíaco es un proceso complejo de diversos tipos de células que interactúan, lo que dificulta la identificación de mutaciones causales no codificantes y sus efectos sobre la regulación génica. La organogénesis del corazón comienza con progenitores celulares que dan lugar a diferentes subtipos de células cardíacas, incluyendo células miocárdicas, fibroblásticas, epicárdicas y endocárdicas 4,5. La genómica unicelular está emergiendo como un método clave para estudiar el desarrollo del corazón y evaluar el impacto de la heterogeneidad celular en la salud y la enfermedad6. El desarrollo de métodos multiómicos para la medición simultánea de diferentes parámetros y la expansión de pipelines computacionales ha facilitado el descubrimiento de tipos y subtipos celulares en el corazón normal y enfermo6. Este artículo describe un protocolo fiable de aislamiento de núcleo único para células progenitoras cardíacas congeladas obtenidas de embriones de ratón que es compatible con snRNA-seq y snATAC-seq aguas abajo (así como snRNA-seq y snATAC-seq combinados)7,8,9.
ATAC-seq es un método robusto que permite la identificación de regiones reguladoras de cromatina abierta y el posicionamiento de nucleosomas10,11. Esta información se utiliza para sacar conclusiones sobre la ubicación, identidad y actividad de los factores de transcripción. La actividad de los factores de cromatina, incluidos los remodeladores, así como la actividad transcripcional de la ARN polimerasa, pueden, por lo tanto, ser analizadas ya que el método es altamente sensible para medir cambios cuantitativos en la estructura de la cromatina 1,2. Por lo tanto, ATAC-seq proporciona un enfoque robusto e imparcial para descubrir los mecanismos que controlan la regulación transcripcional en un tipo de célula específico. Los protocolos ATAC-seq también han sido validados para medir la accesibilidad de la cromatina en células individuales, revelando variabilidad en la arquitectura de la cromatina dentro de las poblaciones celulares10,12,13.
Aunque ha habido avances notables en el campo de las células individuales en los últimos años, la principal dificultad es el procesamiento de las muestras frescas necesarias para realizar estos experimentos14. Para evitar esta dificultad, se han realizado diversas pruebas con el objetivo de realizar análisis como snRNA-seq y snATAC-seq con células o tejido cardíaco congelado15,16.
Se han utilizado varias plataformas para analizar datos genómicos unicelulares17. Las plataformas ampliamente utilizadas para la expresión génica unicelular y el perfil ATAC son plataformas para la encapsulación de gotas microfluídicas múltiples17. Como estas plataformas utilizan cámaras microfluídicas, los desechos o agregados pueden obstruir el sistema, lo que resulta en datos no utilizables. Por lo tanto, el éxito de los estudios de células individuales depende del aislamiento preciso de células / núcleos individuales.
El protocolo presentado aquí utiliza un enfoque similar a estudios recientes que utilizan snRNA-seq y snATAC-seq para comprender los defectos cardíacos congénitos 18,19,20,21,22,23. Este procedimiento utiliza la disociación enzimática de tejido cardíaco recién microdiseccionado seguido de la criopreservación de células progenitoras cardíacas de ratón. Después de la descongelación, las células viables se purifican y procesan para el aislamiento nuclear. En este trabajo, este protocolo se utilizó con éxito para obtener datos de snRNA-seq y snATAC-seq de la misma preparación nuclear de células progenitoras cardíacas de ratón.
Protocol
Representative Results
Discussion
El análisis de la composición celular del corazón en desarrollo por estudios combinados de snRNA-seq y snATAC-seq proporciona una comprensión más profunda del origen de la cardiopatía congénita26. Varios laboratorios de investigación han estudiado los efectos de la criopreservación del tejido cardíaco en snRNA-seq27. La realización de snRNA-seq y snATAC-seq utilizando tejido fresco microdisecado de modelos de ratón de enfermedades humanas puede ser un desafío l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por ERA-CVD-2019 y ANR-JCJC-2020 a SS. Agradecemos a la instalación de Genómica y Bioinformática (GBiM) del laboratorio de Genética Médica U 1251 / Marsella y a los revisores anónimos por proporcionar valiosos comentarios.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
| Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
| Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
| High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
| Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
| Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
| Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin 0.05% – EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
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