Summary

Isolement de noyaux à partir de cellules progénitrices cardiaques de souris pour le profilage de l’épigénome et de l’expression génique à une résolution unicellulaire

Published: May 12, 2023
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Summary

Nous présentons ici un protocole décrivant la préparation des noyaux cellulaires. Après la microdissection et la dissociation enzymatique du tissu cardiaque en cellules individuelles, les cellules progénitrices ont été congelées, suivies de l’isolement de cellules viables pures, qui ont été utilisées pour le séquençage de l’ARN mononucléaire et le test mononucléique pour la chromatine accessible à la transposase avec des analyses de séquençage à haut débit.

Abstract

Le cœur en développement est une structure complexe contenant diverses cellules progénitrices contrôlées par des mécanismes de régulation complexes. L’examen de l’expression génique et de l’état de chromatine des cellules individuelles permet d’identifier le type et l’état cellulaire. Les approches de séquençage unicellulaire ont révélé un certain nombre de caractéristiques importantes de l’hétérogénéité des cellules progénitrices cardiaques. Cependant, ces méthodes sont généralement limitées aux tissus frais, ce qui limite les études avec diverses conditions expérimentales, car les tissus frais doivent être traités immédiatement dans le même cycle pour réduire la variabilité technique. Par conséquent, des procédures simples et flexibles pour produire des données à partir de méthodes telles que le séquençage de l’ARN mononucléal (snRNA-seq) et le test mononucléal pour la chromatine accessible par transposase avec séquençage à haut débit (snATAC-seq) sont nécessaires dans ce domaine. Ici, nous présentons un protocole pour isoler rapidement les noyaux pour les dual-omiques à noyaux simples suivants (snRNA-seq combiné et snATAC-seq). Cette méthode permet d’isoler des noyaux à partir d’échantillons congelés de cellules progénitrices cardiaques et peut être combinée avec des plates-formes utilisant des chambres microfluidiques.

Introduction

Parmi les malformations congénitales, les cardiopathies congénitales (CHD) sont les plus fréquentes, survenant dans environ 1% des naissances vivantes chaque année 1,2. Les mutations génétiques ne sont identifiées que dans une minorité de cas, ce qui implique que d’autres causes, telles que des anomalies dans la régulation des gènes, sont impliquées dans l’étiologie de la coronaropathie 2,3. Le développement cardiaque est un processus complexe de types cellulaires divers et en interaction, ce qui rend difficile l’identification des mutations causales non codantes et de leurs effets sur la régulation des gènes. L’organogenèse du cœur commence par des progéniteurs cellulaires qui donnent naissance à différents sous-types de cellules cardiaques, notamment les cellules myocardiques, fibroblastiques, épicardiques et endocardiques 4,5. La génomique unicellulaire est en train de devenir une méthode clé pour étudier le développement cardiaque et évaluer l’impact de l’hétérogénéité cellulaire sur la santé et la maladie6. Le développement de méthodes multi-omiques pour la mesure simultanée de différents paramètres et l’expansion des pipelines de calcul a facilité la découverte de types et de sous-types cellulaires dans le cœur normal et malade6. Cet article décrit un protocole fiable d’isolement mononucléaire pour les cellules progénitrices cardiaques congelées obtenues à partir d’embryons de souris qui est compatible avec le snRNA-seq et le snATAC-seq en aval (ainsi qu’avec snRNA-seq et snATAC-seq combinés)7,8,9.

ATAC-seq est une méthode robuste qui permet l’identification des régions chromatiques ouvertes régulatrices et le positionnement des nucléosomes10,11. Cette information est utilisée pour tirer des conclusions sur l’emplacement, l’identité et l’activité des facteurs de transcription. L’activité des facteurs de chromatine, y compris les remodeurs, ainsi que l’activité transcriptionnelle de l’ARN polymérase, peuvent donc être analysées car la méthode est très sensible pour mesurer les changements quantitatifs de la structure de la chromatine 1,2. Ainsi, ATAC-seq fournit une approche robuste et impartiale pour découvrir les mécanismes contrôlant la régulation transcriptionnelle dans un type de cellule spécifique. Les protocoles ATAC-seq ont également été validés pour mesurer l’accessibilité de la chromatine dans des cellules individuelles, révélant une variabilité dans l’architecture de la chromatine au sein des populations cellulaires10,12,13.

Bien qu’il y ait eu des progrès notables dans le domaine des cellules individuelles ces dernières années, la principale difficulté est le traitement des échantillons frais nécessaires à la réalisation de ces expériences14. Pour contourner cette difficulté, divers tests ont été réalisés dans le but de réaliser des analyses telles que snRNA-seq et snATAC-seq avec du tissu cardiaque congelé ou des cellules15,16.

Plusieurs plateformes ont été utilisées pour analyser les données génomiques unicellulaires17. Les plateformes largement utilisées pour l’expression génique unicellulaire et le profilage ATAC sont des plateformes pour l’encapsulation de gouttelettes microfluidiques multiples17. Comme ces plates-formes utilisent des chambres microfluidiques, les débris ou les agrégats peuvent obstruer le système, ce qui rend les données inutilisables. Ainsi, le succès des études unicellulaires dépend de l’isolement précis des cellules/noyaux individuels.

Le protocole présenté ici utilise une approche similaire aux études récentes utilisant snRNA-seq et snATAC-seq pour comprendre les malformations cardiaques congénitales 18,19,20,21,22,23. Cette procédure utilise la dissociation enzymatique de tissus cardiaques fraîchement microdisséqués suivie de la cryoconservation de cellules progénitrices cardiaques de souris. Après décongélation, les cellules viables sont purifiées et traitées pour l’isolement nucléaire. Dans ce travail, ce protocole a été utilisé avec succès pour obtenir des données snRNA-seq et snATAC-seq à partir de la même préparation nucléaire de cellules progénitrices cardiaques de souris.

Protocol

La procédure animale adoptée dans cette étude a été approuvée par les comités d’éthique animale de l’Université d’Aix-Marseille (C2EA-14) et a été réalisée selon des protocoles approuvés par le comité national d’éthique de l’expérimentation animale (Ministère de l’Education Nationale, de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche ; Autorisation Apafis N°33927-2021111715507212). 1. Mise en place de l’accouplement programmé avant la dissection…

Representative Results

Par rapport à la préparation de suspensions unicellulaires pour les approches unicellulaires, la préparation de suspensions mononucléiformes est beaucoup plus difficile et nécessite un degré plus élevé de résolution et de traitement. Le facteur clé du succès combiné snRNA-seq et snATAC-seq est une suspension de noyaux propre et intacte. Le protocole pour une isolation efficace des noyaux doit être adapté à chaque type de tissu et à chaque condition (frais ou congelé). Ici, un protocole optimisé est déc…

Discussion

L’analyse de la composition cellulaire du cœur en développement par des études combinées snRNA-seq et snATAC-seq permet de mieux comprendre l’origine des cardiopathies congénitales26. Plusieurs laboratoires de recherche ont étudié les effets de la cryoconservation des tissus cardiaques sur le snRNA-seq27. La réalisation de snRNA-seq et de snATAC-seq à l’aide de tissus micro-disséqués frais provenant de modèles murins de maladie humaine peut être difficile…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été soutenue par ERA-CVD-2019 et ANR-JCJC-2020 à SS. Nous remercions l’installation de génomique et de bioinformatique (GBiM) du laboratoire U 1251/Marseille Medical Genetics et les examinateurs anonymes pour leurs précieux commentaires.

Materials

2100 Bioanalyzer Instrument Agilent No catalog number
5M Sodium chloride (NaCl) Sigma 59222C-500ML 
BSA 10%  Sigma A1595-50ML
Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns 10X Genomics 1000230
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) 10X Genomics 1000285
Countess cell counting chamber slides Invitrogen C10283
Countess III FL Thermofisher No catalog number
Digitonin (5%) Thermofisher BN2006
DMSO Sigma D2650-5x5ML
DNA LoBind Tubes  Eppendorf 22431021
D-PBS Thermofisher 14190094 Sterile and RNase-free
Dual Index Kit TT Set A 96 rxns 10X Genomics 1000215
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes  Fisher Scientific  352096
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes  Fisher Scientific  10788561
HI-FBS Thermofisher A3840001 Heat inactivated
High sensitivity DNA kit Agilent 5067-4626
Igepal CA-630 Sigma I8896-50ML
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit Thermofisher L3224
MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X Miltenyi Biotec 130-090-101
MACS SmartStrainers (30 µm) Miltenyi Biotec 130-098-458
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma M1028-100ML
Milieu McCoy 5A  Thermofisher 16600082
MS Columns Miltenyi Biotec 130-042-201
NovaSeq 6000 S2 Illumina No catalog number
Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) Thermofisher 15070063
PluriStrainer Mini 40µm PluriSelect V-PM15-2021-12
Rock inhibitor Enzo Life Sciences ALX-270-333-M005
Single Index Kit N Set A, 96 rxn 10X Genomics 1000212
Standard 90mm Petri dish Sterilin Thermofisher 101R20
Sterile double-distilled water Thermofisher R0582
Trizma Hydrochloride solution (HCl) Sigma T2194-100ML 
Trypan Blue stain (0.4%) Invitrogen T10282
Trypsin 0.05% – EDTA 1X Thermofisher 25300054
Tween20 Sigma P9416-50ML 
Wide orifice filtered pipette tips 200 μl Labcon 1152-965-008-9
ZEISS SteREO Discovery.V8 ZEISS No catalog number

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Ibrahim, S., Robert, C., Humbert, C., Ferreira, C., Collod, G., Stefanovic, S. Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells for Epigenome and Gene Expression Profiling at Single-Cell Resolution. J. Vis. Exp. (195), e65328, doi:10.3791/65328 (2023).

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