Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung

Unter den Geburtsfehlern sind angeborene Herzfehler (KHK) am häufigsten und treten jedes Jahr bei etwa 1 % der Lebendgeburten^{auf 1,2}. Genetische Mutationen werden nur in einer Minderheit der Fälle identifiziert, was darauf hindeutet, dass andere Ursachen, wie z. B. Anomalien in der Genregulation, an der Ätiologie der KHK beteiligt sind ^2,3. Die kardiale Entwicklung ist ein komplexer Prozess verschiedener und interagierender Zelltypen, was die Identifizierung kausaler nicht-kodierender Mutationen und ihrer Auswirkungen auf die Genregulation schwierig macht. Die Organogenese des Herzens beginnt mit zellulären Vorläuferzellen, aus denen verschiedene Subtypen von Herzzellen hervorgehen, darunter Myokard-, Fibroblasten-, Epikard- und Endokardzellen ^4,5. Die Einzelzellgenomik entwickelt sich zu einer Schlüsselmethode für die Untersuchung der Herzentwicklung und die Bewertung der Auswirkungen zellulärer Heterogenität auf Gesundheit und Krankheit⁶. Die Entwicklung von Multi-Omics-Methoden zur gleichzeitigen Messung verschiedener Parameter und der Ausbau von Rechenpipelines haben die Entdeckung von Zelltypen und -subtypen im normalen und erkrankten Herzen ermöglicht⁶. Dieser Artikel beschreibt ein zuverlässiges Einzelkern-Isolationsprotokoll für gefrorene kardiale Vorläuferzellen, das aus Mausembryonen gewonnen wurde und mit nachgeschalteten snRNA-seq und snATAC-seq (sowie snRNA-seq und snATAC-seq kombiniert) kompatibel ^ist7,8,9.

ATAC-seq ist eine robuste Methode, die die Identifizierung regulatorisch offener Chromatinregionen und die Positionierung von Nukleosomen^{ermöglicht 10,11}. Diese Informationen werden verwendet, um Rückschlüsse auf den Ort, die Identität und die Aktivität von Transkriptionsfaktoren zu ziehen. Die Aktivität von Chromatinfaktoren, einschließlich Remodelern, sowie die Transkriptionsaktivität der RNA-Polymerase können somit analysiert werden, da die Methode für die Messung quantitativer Veränderungen in der Chromatinstruktur hochempfindlich ist ^1,2. Somit bietet ATAC-seq einen robusten und unparteiischen Ansatz, um die Mechanismen aufzudecken, die die transkriptionelle Regulation in einem bestimmten Zelltyp steuern. ATAC-seq-Protokolle wurden auch validiert, um die Chromatinzugänglichkeit in einzelnen Zellen zu messen, was die Variabilität der Chromatinarchitektur innerhalb von Zellpopulationen aufzeigt^10,12,13.

Obwohl es in den letzten Jahren bemerkenswerte Fortschritte auf dem Gebiet der Einzelzellen gegeben hat, besteht die Hauptschwierigkeit in der Verarbeitung der frischen Proben, die für die Durchführung dieser Experimente benötigt werden¹⁴. Um diese Schwierigkeit zu umgehen, wurden verschiedene Tests mit dem Ziel durchgeführt, Analysen wie snRNA-seq und snATAC-seq mit gefrorenem Herzgewebe oder -zellen durchzuführen^15,16.

Mehrere Plattformen wurden verwendet, um Einzelzell-Genomikdaten zu analysieren¹⁷. Die weit verbreiteten Plattformen für die Einzelzell-Genexpression und die ATAC-Profilerstellung sind Plattformen für die Verkapselung mehrerer mikrofluidischer Tröpfchen¹⁷. Da diese Plattformen mikrofluidische Kammern verwenden, können Schmutz oder Aggregate das System verstopfen, was zu unbrauchbaren Daten führt. Der Erfolg von Einzelzellstudien hängt also von der genauen Isolierung einzelner Zellen/Kerne ab.

Das hier vorgestellte Protokoll verwendet einen ähnlichen Ansatz wie neuere Studien, in denen snRNA-seq und snATAC-seq verwendet werden, um angeborene Herzfehler zu verstehen 18,19,20,21,22,23. Bei diesem Verfahren wird die enzymatische Dissoziation von frisch mikropräpariertem Herzgewebe mit anschließender Kryokonservierung von kardialen Vorläuferzellen der Maus verwendet. Nach dem Auftauen werden die lebensfähigen Zellen gereinigt und für die Kernisolierung aufbereitet. In dieser Arbeit wurde dieses Protokoll erfolgreich verwendet, um snRNA-seq- und snATAC-seq-Daten aus der gleichen Kernpräparation von kardialen Vorläuferzellen der Maus zu erhalten.