Summary

Isolamento de Núcleos de Células Progenitoras Cardíacas de Camundongos para Perfil de Epigenoma e Expressão Gênica em Resolução Unicelular

Published: May 12, 2023
doi:

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo a preparação de núcleos celulares. Após microdissecção e dissociação enzimática do tecido cardíaco em células únicas, as células progenitoras foram congeladas, seguidas pelo isolamento de células viáveis puras, que foram usadas para sequenciamento de RNA de núcleo único e o ensaio de núcleo único para cromatina acessível à transposase com análises de sequenciamento de alto rendimento.

Abstract

O coração em desenvolvimento é uma estrutura complexa contendo várias células progenitoras controladas por mecanismos regulatórios complexos. O exame da expressão gênica e do estado da cromatina de células individuais permite a identificação do tipo e estado celular. Abordagens de sequenciamento unicelular têm revelado uma série de características importantes da heterogeneidade de células progenitoras cardíacas. No entanto, esses métodos são geralmente restritos ao tecido fresco, o que limita estudos com diversas condições experimentais, pois o tecido fresco deve ser processado de uma só vez no mesmo período para reduzir a variabilidade técnica. Portanto, procedimentos fáceis e flexíveis para produzir dados de métodos como o sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA-seq) e o ensaio de núcleo único para cromatina acessível à transposase com sequenciamento de alto rendimento (snATAC-seq) são necessários nesta área. Aqui, apresentamos um protocolo para isolar rapidamente núcleos para núcleos únicos subsequentes dual-omics (snRNA-seq e snATAC-seq combinados). Este método permite o isolamento de núcleos de amostras congeladas de células progenitoras cardíacas e pode ser combinado com plataformas que utilizam câmaras microfluídicas.

Introduction

Dentre os defeitos congênitos, os defeitos cardíacos congênitos (DCC) são os mais comuns, ocorrendo em cerca de 1% dos nascidos vivos a cada ano 1,2. Mutações genéticas são identificadas em apenas uma minoria dos casos, implicando que outras causas, como anormalidades na regulação gênica, estão envolvidas na etiologia daCC2,3. O desenvolvimento cardíaco é um processo complexo de tipos celulares diversos e interagentes, tornando desafiadora a identificação de mutações causais não codificantes e seus efeitos na regulação gênica. A organogênese do coração inicia-se com progenitores celulares que dão origem a diferentes subtipos de células cardíacas,incluindo células miocárdicas, fibroblastas, epicárdicas e endocárdicas4,5. A genômica unicelular está emergindo como um método-chave para estudar o desenvolvimento cardíaco e avaliar o impacto da heterogeneidade celular na saúde e na doença6. O desenvolvimento de métodos multi-ômicos para a mensuração simultânea de diferentes parâmetros e a expansão de pipelines computacionais tem facilitado a descoberta de tipos e subtipos celulares no coração normal edoente6. Este artigo descreve um protocolo confiável de isolamento de núcleo único para células progenitoras cardíacas congeladas obtidas de embriões de camundongos que é compatível com snRNA-seq e snATAC-seq a jusante (bem como snRNA-seq e snATAC-seq combinados)7,8,9.

O ATAC-seq é um método robusto que permite a identificação de regiões reguladoras da cromatina aberta e o posicionamento de nucleossomos10,11. Essas informações são usadas para tirar conclusões sobre a localização, identidade e atividade dos fatores de transcrição. A atividade de fatores da cromatina, incluindo remodeladores, bem como a atividade transcricional da RNA polimerase, podem, portanto, ser analisadas, uma vez que o método é altamente sensível para medir mudanças quantitativas na estrutura da cromatina 1,2. Assim, ATAC-seq fornece uma abordagem robusta e imparcial para descobrir os mecanismos que controlam a regulação transcricional em um tipo celular específico. Protocolos ATAC-seq também foram validados para medir a acessibilidade da cromatina em células isoladas, revelando variabilidade na arquitetura da cromatina dentro de populações celulares10,12,13.

Embora tenha havido notáveis avanços no campo das células isoladas nos últimos anos, a principal dificuldade é o processamento das amostras frescas necessárias para a realização dessesexperimentos14. Para contornar essa dificuldade, vários testes têm sido realizados com o objetivo de realizar análises como snRNA-seq e snATAC-seq com tecido cardíaco congeladoou células 15,16.

Várias plataformas têm sido utilizadas para analisar dados de genômica unicelular17. As plataformas amplamente utilizadas para expressão gênica de célula única e perfil ATAC são plataformas para encapsulamento de gotículas microfluídicas múltiplas17. Como essas plataformas utilizam câmaras microfluídicas, detritos ou agregados podem entupir o sistema, resultando em dados inutilizáveis. Assim, o sucesso de estudos unicelulares depende do isolamento preciso de células/núcleos individuais.

O protocolo aqui apresentado utiliza abordagem semelhante a estudos recentes utilizando snRNA-seq e snATAC-seq para compreensão de cardiopatias congênitas 18,19,20,21,22,23. Este procedimento utiliza a dissociação enzimática do tecido cardíaco recém-microdissecado seguido da criopreservação de células progenitoras cardíacas de camundongos. Após o descongelamento, as células viáveis são purificadas e processadas para isolamento nuclear. Neste trabalho, este protocolo foi utilizado com sucesso para obter dados de snRNA-seq e snATAC-seq a partir da mesma preparação nuclear de células progenitoras cardíacas de camundongos.

Protocol

O procedimento animal adotado neste estudo foi aprovado pelos comitês de ética animal da Universidade Aix-Marseille (C2EA-14) e foi realizado de acordo com protocolos aprovados pelo comitê nacional de ética para experimentação animal (Ministère de l’Education Nationale, de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche; Autorização Apafis N°33927-2021111715507212). 1. Configurando o acasalamento cronometrado antes da dissecação Para gerar embriões de camun…

Representative Results

Em comparação com a preparação de suspensões de célula única para abordagens de célula única, a preparação de suspensões de núcleo único é muito mais desafiadora e requer um maior grau de resolução e processamento. O fator chave para o sucesso da combinação combinada de snRNA-seq e snATAC-seq é uma suspensão de núcleos limpa e intacta. O protocolo para isolamento eficiente dos núcleos deve ser adaptado a cada tipo e condição de tecido (fresco ou congelado). Aqui, um protocolo otimizado é descrit…

Discussion

A análise da composição celular do coração em desenvolvimento por meio de estudos combinados de snRNA-seq e snATAC-seq fornece uma compreensão mais profunda da origem da cardiopatiacongênita26. Vários laboratórios de pesquisa têm estudado os efeitos da criopreservação de tecido cardíaco no snRNA-seq27. A condução de snRNA-seq e snATAC-seq usando tecido fresco microdissecado de modelos murinos de doença humana pode ser logisticamente desafiadora quando se com…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada por ERA-CVD-2019 e ANR-JCJC-2020 para SS. Agradecemos ao centro de Genômica e Bioinformática (GBiM) do laboratório U 1251/Marseille Medical Genetics e aos revisores anônimos por fornecerem comentários valiosos.

Materials

2100 Bioanalyzer Instrument Agilent No catalog number
5M Sodium chloride (NaCl) Sigma 59222C-500ML 
BSA 10%  Sigma A1595-50ML
Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns 10X Genomics 1000230
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) 10X Genomics 1000285
Countess cell counting chamber slides Invitrogen C10283
Countess III FL Thermofisher No catalog number
Digitonin (5%) Thermofisher BN2006
DMSO Sigma D2650-5x5ML
DNA LoBind Tubes  Eppendorf 22431021
D-PBS Thermofisher 14190094 Sterile and RNase-free
Dual Index Kit TT Set A 96 rxns 10X Genomics 1000215
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes  Fisher Scientific  352096
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes  Fisher Scientific  10788561
HI-FBS Thermofisher A3840001 Heat inactivated
High sensitivity DNA kit Agilent 5067-4626
Igepal CA-630 Sigma I8896-50ML
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit Thermofisher L3224
MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X Miltenyi Biotec 130-090-101
MACS SmartStrainers (30 µm) Miltenyi Biotec 130-098-458
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma M1028-100ML
Milieu McCoy 5A  Thermofisher 16600082
MS Columns Miltenyi Biotec 130-042-201
NovaSeq 6000 S2 Illumina No catalog number
Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) Thermofisher 15070063
PluriStrainer Mini 40µm PluriSelect V-PM15-2021-12
Rock inhibitor Enzo Life Sciences ALX-270-333-M005
Single Index Kit N Set A, 96 rxn 10X Genomics 1000212
Standard 90mm Petri dish Sterilin Thermofisher 101R20
Sterile double-distilled water Thermofisher R0582
Trizma Hydrochloride solution (HCl) Sigma T2194-100ML 
Trypan Blue stain (0.4%) Invitrogen T10282
Trypsin 0.05% – EDTA 1X Thermofisher 25300054
Tween20 Sigma P9416-50ML 
Wide orifice filtered pipette tips 200 μl Labcon 1152-965-008-9
ZEISS SteREO Discovery.V8 ZEISS No catalog number

References

  1. vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
  2. Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
  3. Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: The contribution of the noncoding regulatory genome. Journal of Human Genetics. 61 (1), 13-19 (2016).
  4. Buijtendijk, M. F. J., Barnett, P., vanden Hoff, M. J. B. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 184 (1), 7-22 (2020).
  5. Sylva, M., vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part A. 164 (6), 1347-1371 (2014).
  6. Gromova, T., Gehred, N. D., Vondriska, T. M. Single-cell transcriptomes in the heart: When every epigenome counts. Cardiovascular Research. 119 (1), 64-78 (2022).
  7. Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
  8. Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: Techniques and emerging applications. Nature Reviews. Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
  9. Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-cell multiomics: Multiple measurements from single cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
  10. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 1-9 (2015).
  11. Stefanovic, S., et al. Hox-dependent coordination of mouse cardiac progenitor cell patterning and differentiation. Elife. 9, e55124 (2020).
  12. Xu, W., et al. A plate-based single-cell ATAC-seq workflow for fast and robust profiling of chromatin accessibility. Nature Protocols. 16 (8), 4084-4107 (2021).
  13. Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
  14. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
  15. Safabakhsh, S., et al. Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing. Current Protocols. 2 (7), e480 (2022).
  16. Pimpalwar, N., et al. Methods for isolation and transcriptional profiling of individual cells from the human heart. Heliyon. 6 (12), 05810 (2020).
  17. 10x Genomics. Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Kits User Guide. 10x Genomics. , (2022).
  18. Jia, G., et al. Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement. Nature Communications. 9 (1), 4877 (2018).
  19. Wang, L., et al. Single-cell dual-omics reveals the transcriptomic and epigenomic diversity of cardiac non-myocytes. Cardiovascular Research. 118 (6), 1548-1563 (2022).
  20. Wang, Z., et al. Cell-type-specific gene regulatory networks underlying murine neonatal heart regeneration at single-cell resolution. Cell Reports. 35 (8), 109211 (2021).
  21. Ameen, M., et al. Integrative single-cell analysis of cardiogenesis identifies developmental trajectories and non-coding mutations in congenital heart disease. Cell. 185 (26), 4937-4953 (2022).
  22. Gao, R., et al. Pioneering function of Isl1 in the epigenetic control of cardiomyocyte cell fate. Cell Research. 29 (6), 486-501 (2019).
  23. Manivannan, S., et al. Single-cell transcriptomic profiling unveils dysregulation of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in a mouse model of maternal hyperglycemia. Communications Biology. 5 (1), 820 (2022).
  24. Cao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data with structural similarity. Nucleic Acids Research. 50 (21), e121 (2022).
  25. What is CellRanger. 10x Genomics Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger (2023)
  26. Hill, M. C. Integrated multi-omic characterization of congenital heart disease. Nature. 608 (7921), 181-191 (2022).
  27. Chen, Z., Wei, L., Duru, F., Chen, L. Single-cell RNA sequencing: In-depth decoding of heart biology and cardiovascular diseases. Current Genomics. 21 (8), 585-601 (2020).
  28. Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: Emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 31 (11), 888-897 (2021).
  29. Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  30. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  31. Haghverdi, L., Lun, A. T. L., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Batch effects in single-cell RNA-sequencing data are corrected by matching mutual nearest neighbors. Nature Biotechnology. 36 (5), 421-427 (2018).
  32. Yang, Y., et al. SMNN: Batch effect correction for single-cell RNA-seq data via supervised mutual nearest neighbor detection. Briefings in Bioinformatics. 22 (3), 097 (2021).
  33. Stefanovic, S., Christoffels, V. M. GATA-dependent transcriptional and epigenetic control of cardiac lineage specification and differentiation. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (20), 3871-3881 (2015).
  34. Gunthel, M., Barnett, P., Christoffels, V. M. Development, proliferation, and growth of the mammalian heart. Molecular Therapy. 26 (7), 1599-1609 (2018).
  35. Stefanovic, S., Etchevers, H. C., Zaffran, S. Outflow tract formation-embryonic origins of conotruncal congenital heart disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 42 (2021).
  36. Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
  37. Bai, H., Lin, M., Meng, Y., Bai, H., Cai, S. An improved CUT&RUN method for regulation network reconstruction of low abundance transcription factor. Cellular Signalling. 96, 110361 (2022).

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Ibrahim, S., Robert, C., Humbert, C., Ferreira, C., Collod, G., Stefanovic, S. Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells for Epigenome and Gene Expression Profiling at Single-Cell Resolution. J. Vis. Exp. (195), e65328, doi:10.3791/65328 (2023).

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