Isolamento de Núcleos de Células Progenitoras Cardíacas de Camundongos para Perfil de Epigenoma e Expressão Gênica em Resolução Unicelular

Dentre os defeitos congênitos, os defeitos cardíacos congênitos (DCC) são os mais comuns, ocorrendo em cerca de 1% dos nascidos vivos a cada ano ^1,2. Mutações genéticas são identificadas em apenas uma minoria dos casos, implicando que outras causas, como anormalidades na regulação gênica, estão envolvidas na etiologia da^CC2,3. O desenvolvimento cardíaco é um processo complexo de tipos celulares diversos e interagentes, tornando desafiadora a identificação de mutações causais não codificantes e seus efeitos na regulação gênica. A organogênese do coração inicia-se com progenitores celulares que dão origem a diferentes subtipos de células cardíacas,^{incluindo células} miocárdicas, fibroblastas, epicárdicas e endocárdicas4,5. A genômica unicelular está emergindo como um método-chave para estudar o desenvolvimento cardíaco e avaliar o impacto da heterogeneidade celular na saúde e na doença⁶. O desenvolvimento de métodos multi-ômicos para a mensuração simultânea de diferentes parâmetros e a expansão de pipelines computacionais tem facilitado a descoberta de tipos e subtipos celulares no coração normal e^doente6. Este artigo descreve um protocolo confiável de isolamento de núcleo único para células progenitoras cardíacas congeladas obtidas de embriões de camundongos que é compatível com snRNA-seq e snATAC-seq a jusante (bem como snRNA-seq e snATAC-seq combinados)^7,8,9.

O ATAC-seq é um método robusto que permite a identificação de regiões reguladoras da cromatina aberta e o posicionamento de nucleossomos^10,11. Essas informações são usadas para tirar conclusões sobre a localização, identidade e atividade dos fatores de transcrição. A atividade de fatores da cromatina, incluindo remodeladores, bem como a atividade transcricional da RNA polimerase, podem, portanto, ser analisadas, uma vez que o método é altamente sensível para medir mudanças quantitativas na estrutura da cromatina ^1,2. Assim, ATAC-seq fornece uma abordagem robusta e imparcial para descobrir os mecanismos que controlam a regulação transcricional em um tipo celular específico. Protocolos ATAC-seq também foram validados para medir a acessibilidade da cromatina em células isoladas, revelando variabilidade na arquitetura da cromatina dentro de populações celulares^10,12,13.

Embora tenha havido notáveis avanços no campo das células isoladas nos últimos anos, a principal dificuldade é o processamento das amostras frescas necessárias para a realização desses^{experimentos14}. Para contornar essa dificuldade, vários testes têm sido realizados com o objetivo de realizar análises como snRNA-seq e snATAC-seq com tecido cardíaco congelado^{ou células 15,16}.

Várias plataformas têm sido utilizadas para analisar dados de genômica unicelular¹⁷. As plataformas amplamente utilizadas para expressão gênica de célula única e perfil ATAC são plataformas para encapsulamento de gotículas microfluídicas múltiplas¹⁷. Como essas plataformas utilizam câmaras microfluídicas, detritos ou agregados podem entupir o sistema, resultando em dados inutilizáveis. Assim, o sucesso de estudos unicelulares depende do isolamento preciso de células/núcleos individuais.

O protocolo aqui apresentado utiliza abordagem semelhante a estudos recentes utilizando snRNA-seq e snATAC-seq para compreensão de cardiopatias congênitas 18,19,20,21,22,23. Este procedimento utiliza a dissociação enzimática do tecido cardíaco recém-microdissecado seguido da criopreservação de células progenitoras cardíacas de camundongos. Após o descongelamento, as células viáveis são purificadas e processadas para isolamento nuclear. Neste trabalho, este protocolo foi utilizado com sucesso para obter dados de snRNA-seq e snATAC-seq a partir da mesma preparação nuclear de células progenitoras cardíacas de camundongos.