卟啉修饰微球用作流式细胞术补偿质控

卟啉因其荧光和肿瘤靶^{向特性而在}生物医学领域引起了多年的关注1，^2，3。光动力疗法（PDT）和声动力疗法（SDT）等治疗应用需要向癌症患者全身施用卟啉，药物在肿瘤中的积累以及肿瘤局部暴露于特定波长的激光或超声波。暴露于激光或超声波会导致卟啉产生活性氧，随后细胞死亡^4，5。在光动力诊断（PDD）中，卟啉荧光用于区分癌细胞和正常细胞⁶。在这种情况下，原卟啉 IX 是一种天然荧光卟啉，在全身或局部注射其前体 5-氨基乙酰丙酸 （5-ALA） 后积聚在肿瘤中，用于识别胃肠道间质瘤、膀胱癌和脑癌^7，8。最近，探索了5-ALA治疗作为检测多发性^骨髓瘤9中微小残留病的方法。我们的实验室一直在使用四芳基卟啉TCPP（5，10，15，20-四-（4-羧基苯基）-21，23H-卟啉），因为它能够选择性地染色人痰样本中的肺癌细胞和癌症相关细胞，这一特性已在基于玻片和流式细胞术诊断测定中得到利用¹⁰。

一些卟啉是双功能的，因为它们可以用作治疗和诊断剂^2，11。在生物医学研究中，这种双功能卟啉用于评估它们选择性靶向和杀死癌细胞的能力如何是其结构的功能，以及它如何受到其他化合物^12，13，¹⁴，^15，16的影响。卟啉的细胞摄取及其细胞毒性都可以在流式细胞术平台上以高通量方式测量。荧光卟啉的吸收和发射光谱很复杂，但大多数流式细胞术平台都配备了正确识别它们的能力。荧光卟啉的吸收光谱的特征在于380-500nm范围内的强吸收带，称为Soret带。通常在 500-750 nm 范围（Q 波段）中观察到两到四个较弱的吸收带¹⁷。大多数流式细胞仪中存在的蓝色 488 nm 激光或紫色激光 （405 nm） 可以产生适当波长的光来激发卟啉。卟啉的发射光谱通常显示600-800nm范围内¹⁸的峰，这导致与异硫氰酸荧光素或藻红蛋白（PE）荧光团的光谱重叠非常小，但与其他常用的荧光团（如别藻蓝蛋白（APC））以及串联荧光团（如PE-Cy5等）有相当大的重叠。因此，在多色流式细胞术测定中使用卟啉时，单荧光团对照对于充分校正荧光在指定用于测量卟啉荧光的通道以外的通道中的溢出至关重要。

理想情况下，用于计算一组荧光团溢出基质的单荧光基团对照（也称为“补偿对照”）应由与样品相同的细胞类型组成。但是，如果开始时的样本很少，或者样本中的目标人群非常小（例如，如果想在疾病的早期阶段观察微小的残留疾病或癌细胞），则为此目的使用样本并不是最佳的。细胞的有用替代品是微球与用于分析样品的相同荧光团耦合。许多这样的珠子是市售的;这些磁珠要么用所需的荧光团预标记（预标记的荧光团特异性微球）¹⁹，20，要么可以将荧光标记的抗体附着在其上（抗体捕获珠）^20，21。虽然商业补偿微球可用于许多荧光团，但此类微球不适用于卟啉，尽管它们在基础和临床研究中的使用越来越多。

除了样品保存和适当大小的阳性与阴性群体外，使用微球作为补偿对照的其他优点是易于制备、低背景荧光和随时间推移的出色稳定性²²。使用磁珠作为补偿对照的潜在缺点是，磁珠上捕获的荧光抗体的发射光谱可能与用于标记细胞的相同抗体的发射光谱不同。当使用光谱流式细胞仪²⁰时，这可能具有特别重要的意义。因此，需要在流式细胞仪上进行磁珠作为补偿对照的开发，该流式细胞仪将用于开发磁珠的测定。此外，磁珠的显影需要包括与用相同荧光染色试剂标记的细胞进行比较。

在这里，我们描述了TCPP胺官能化聚苯乙烯补偿珠的制备，其检测通道中的中位荧光强度与痰液中TCPP标记细胞的荧光强度相当，以及它们作为流式细胞术的补偿对照的用途。等效的非功能化微球的自发荧光足够低，可以用作负荧光补偿对照。此外，这些磁珠在储存中表现出近 1 年的稳定性。