フローサイトメトリーの補正コントロールとして使用するポルフィリン修飾ビーズ

ポルフィリンは、その蛍光特性と腫瘍標的特性により、生物医学分野で長年にわたって関心を集めてきました^1,2,3。光線力学療法(PDT)およびソノダイナミック療法(SDT)などの治療用途は、癌患者へのポルフィリンの全身投与、腫瘍における薬物の蓄積、および特定の波長のレーザー光または超音波への腫瘍の局所的曝露を伴う。レーザー光または超音波への曝露は、ポルフィリンによる活性酸素種の生成とそれに続く細胞死につながります^4,5。光線力学的診断(PDD)では、ポルフィリン蛍光を使用して癌細胞と正常細胞を区別します⁶。これに関連して、プロトポルフィリンIXは、その前駆体である5-アミノレブリン酸(5-ALA)の全身または局所注射時に腫瘍に蓄積する天然の蛍光ポルフィリンであり、消化管間質腫瘍、膀胱癌、および脳腫瘍を特定するために使用されます^7,8。最近では、多発性骨髄腫における最小限の残存病変を検出するためのアプローチとして5-ALA治療が検討された⁹。当研究室では、テトラアリールポルフィリンTCPP(5,10,15,20-テトラキス-(4-カルボキシフェニル)-21,23H-ポルフィン)を用いており、ヒト喀痰検体中の肺がん細胞やがん関連細胞を選択的に染色することができ、スライドベースやフローサイトメトリー診断アッセイで利用されている特性です¹⁰。

いくつかのポルフィリンは、治療薬および診断薬として使用できるという点で二機能性である^2,11。生物医学研究では、このような二官能性ポルフィリンを使用して、癌細胞を選択的に標的にして殺す能力がそれらの構造の関数であり、他の化合物の存在によってどのように影響を受けるかを評価します¹²、13、¹⁴、^15、16。ポルフィリンの細胞内取り込みとその細胞毒性の両方を、フローサイトメトリープラットフォームでハイスループットな方法で測定できます。蛍光ポルフィリンの吸収スペクトルと発光スペクトルは複雑ですが、ほとんどのフローサイトメトリープラットフォームはそれらを正しく識別するために装備されています。蛍光ポルフィリンの吸収スペクトルは、ソーレー帯として知られる380〜500nmの範囲の強い吸収帯によって特徴付けられる。一般に、500〜750 nmの範囲(Qバンド)で2〜4個の弱い吸収バンドが観察されます¹⁷。ほとんどのフローサイトメーターに存在する青色の488 nmレーザー、または紫色レーザー(405 nm)は、ポルフィリンを励起するための適切な波長の光を生成できます。ポルフィリンの発光スペクトルは通常、600〜800 nmの範囲にピークを示し¹⁸、フルオレセインイソチオシアネートまたはフィコエリスリン(PE)フルオロフォアとのスペクトルオーバーラップはほとんどありませんが、アロフィコシアニン(APC)などの他のよく使用されるフルオロフォアや、PE-Cy5などのタンデムフルオロフォアとはかなり重複します。したがって、マルチカラーフローサイトメトリーアッセイでポルフィリンを使用する場合、ポルフィリンの蛍光を測定するために指定されたチャネル以外のチャネルでの蛍光のスピルオーバーを適切に補正するには、シングルフルオロフォアコントロールが不可欠です。

理想的には、蛍光色素パネルのスピルオーバーマトリックスの計算に使用される単一蛍光色素コントロール(「補正コントロール」とも呼ばれます)は、サンプルと同じ細胞タイプで構成されている必要があります。ただし、そもそもサンプルが非常に少ない場合、またはサンプル内のターゲット集団が非常に少ない場合(たとえば、病気の初期段階で最小限の残存疾患または癌細胞を調べたい場合)は、この目的でサンプルを使用することは最適ではありません。細胞の有用な代替物は、サンプルの分析に使用されるのと同じ蛍光色素と結合されたビーズです。そのようなビーズの多くは市販されている。これらのビーズは、目的の蛍光色素で事前に標識されているか(標識済み蛍光色素特異的ビーズ)^19,20、または蛍光標識された抗体をそれらに付着させることができます(抗体捕捉ビーズ)^20,21。市販の補正ビーズは多くの蛍光色素に利用できますが、このようなビーズは基礎研究や臨床研究での使用が増加しているにもかかわらず、ポルフィリンには利用できません。

サンプルの保存と適切なサイズのポジティブ集団とネガティブ集団に加えて、ビーズを補償コントロールとして使用する他の利点は、調製の容易さ、低バックグラウンド蛍光、および長期にわたる優れた安定性です²²。ビーズを補償コントロールとして使用することの潜在的な欠点は、ビーズに捕捉された蛍光抗体の発光スペクトルが、細胞の標識に使用される同じ抗体の発光スペクトルと異なる可能性があることです。これは、スペクトルフローサイト^{メーター20}を使用する場合に特に重要であり得る。したがって、補償制御としてのビーズの開発は、ビーズが開発されるアッセイに使用されるフローサイトメーター上で行われる必要がある。さらに、ビーズの開発には、同じ蛍光染色試薬で標識された細胞との比較を含める必要があります。

ここでは、検出チャネル内の蛍光強度の中央値が喀痰中のTCPP標識細胞と同等であったTCPPアミン官能化ポリスチレン補正ビーズの調製と、フローサイトメトリーの補正コントロールとしての使用について説明します。同等の非官能化ビーズの自家蛍光は、負の蛍光補償対照として使用するには十分に低かった。さらに、これらのビーズは、ほぼ1年間の貯蔵安定性を示しました。