חרוזים מהונדסים בפורפירין לשימוש כבקרות פיצוי בציטומטריית זרימה
Summary
הפרוטוקול מתאר כיצד חרוזי פיצוי מבוססי פורפירין עבור ציטומטריית זרימה מוכנים על ידי התגובה של חרוזי פוליסטירן פונקציונליים אמין עם TCPP פורפירין ומגיב צימוד אמיד EDC. הליך סינון משמש כדי להפחית את תוצרי הלוואי של החלקיקים.
Abstract
ציטומטריית זרימה יכולה לאפיין ולכמת במהירות אוכלוסיות תאים מגוונות בהתבסס על מדידות פלואורסצנטיות. התאים מוכתמים תחילה בריאגנטים פלואורסצנטיים אחד או יותר, כאשר כל אחד מהם מתפקד עם מולקולה פלואורסצנטית אחרת (פלואורופור) הנקשרת לתאים באופן סלקטיבי בהתבסס על המאפיינים הפנוטיפיים שלהם, כגון ביטוי אנטיגן בפני השטח של התא. את עוצמת הפלואורסצנטיות מכל מגיב הקשור לתאים ניתן למדוד על ציטומטר הזרימה באמצעות ערוצים המזהים טווח מוגדר של אורכי גל. כאשר משתמשים בפלואורופורים מרובים, האור מפלואורופורים בודדים גולש לעתים קרובות לתעלות גילוי לא רצויות, מה שדורש תיקון לנתוני עוצמת הפלואורסצנטיות בתהליך שנקרא פיצוי.
חלקיקי בקרת פיצוי, בדרך כלל חרוזי פולימר הקשורים לפלואורופור יחיד, נדרשים עבור כל פלואורופור המשמש בניסוי תיוג תאים. נתונים מחלקיקי פיצוי מציטומטר הזרימה משמשים ליישום תיקון למדידות עוצמת הפלואורסצנטיות. פרוטוקול זה מתאר הכנה וטיהור של חרוזי פיצוי פוליסטירן המתפקדים באופן קוולנטי עם מגיב פלואורסצנטי מזו-טטרה (4-קרבוקסיפניל) פורפין (TCPP) ויישומם בפיצוי ציטומטריית זרימה. בעבודה זו, חרוזי פוליסטירן פונקציונליים של אמין טופלו באמצעות TCPP ומגיב צימוד אמיד EDC (N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride) ב- pH 6 ובטמפרטורת החדר במשך 16 שעות עם תסיסה. חרוזי TCPP בודדו על ידי צנטריפוגה והושעו מחדש במאגר pH 7 לאחסון. חלקיקים הקשורים ל-TCPP נצפו כתוצר לוואי. ניתן להפחית את מספר החלקיקים הללו באמצעות פרוטוקול סינון אופציונלי. חרוזי TCPP שהתקבלו שימשו בהצלחה על ציטומטר זרימה לפיצוי בניסויים עם תאי כיח אנושיים שסומנו עם פלואורופורים מרובים. חרוזי TCPP הוכחו כיציבים לאחר אחסון במקרר במשך 300 יום.
Introduction
פורפירינים היו בעלי עניין במשך שנים רבות בתחום הביו-רפואי בשל תכונותיהם הפלואורסצנטיות וממוקדות הגידול 1,2,3. יישומים טיפוליים כגון טיפול פוטודינמי (PDT) וטיפול סונודינמי (SDT) כרוכים במתן סיסטמי של פורפירין לחולה סרטן, הצטברות התרופה בגידול וחשיפה מקומית של הגידול לאור לייזר באורך גל מסוים או אולטרסאונד. החשיפה לאור לייזר או אולטרסאונד מובילה ליצירת מיני חמצן תגובתי על ידי הפורפירין ולאחר מכן למוות תאי 4,5. באבחון פוטודינמי (PDD), פורפירין פלואורסצנטי משמש להבדיל בין תאים סרטניים לתאים נורמליים6. בהקשר זה, פרוטופורפירין IX, פורפירין פלואורסצנטי טבעי המצטבר בגידולים עם הזרקה מערכתית או מקומית של קודמו, חומצה 5-אמינולבולינית (5-ALA), משמש לזיהוי גידולי סטרומה במערכת העיכול, סרטן שלפוחית השתן וסרטן המוח 7,8. לאחרונה, טיפול 5-ALA נחקר כגישה לאיתור מחלה שיורית מינימלית במיאלומה נפוצה9. המעבדה שלנו השתמשה בטטראריל פורפירין TCPP (5,10,15,20-טטרקיס-(4-קרבוקסיפניל)-21,23 H-פורפין) בשל יכולתו להכתים באופן סלקטיבי תאי סרטן ריאה ותאים הקשורים לסרטן בדגימות כיח אנושיות, תכונה שנוצלה בבדיקות אבחון ציטומטריות מבוססות שקופיות וזרימה10.
חלק מהפורפירינים הם דו-תפקודיים בכך שהם יכולים לשמש כסוכנים טיפוליים ואבחוניים 2,11. במחקר ביו-רפואי, פורפירינים דו-תפקודיים כאלה משמשים כדי להעריך כיצד יכולתם להתמקד באופן סלקטיבי ולהרוג תאים סרטניים היא פונקציה של המבנה שלהם, כמו גם כיצד הוא מושפע מנוכחותן של תרכובות אחרות 12,13,14,15,16. ניתן למדוד הן את ספיגת התאים של פורפירינים והן את ציטוטוקסיות שלהם על פלטפורמה ציטומטרית של זרימה באופן בתפוקה גבוהה. ספקטרום הספיגה והפליטה של פורפירינים פלואורסצנטיים הוא מורכב, אך רוב הפלטפורמות הציטומטריות של הזרימה מצוידות כדי לזהות אותן נכון. ספקטרום הספיגה של פורפירינים פלואורסצנטיים מאופיין ברצועת ספיגה חזקה בתחום 380-500 ננומטר, המכונה רצועת סורט. שתיים עד ארבע רצועות ספיגה חלשות יותר נצפות בדרך כלל בתחום התדרים 500-750 ננומטר (Q)17. לייזר כחול של 488 ננומטר, שנמצא ברוב הציטומטרים של זרימה, או לייזר סגול (405 ננומטר) יכולים להפיק אור באורך הגל המתאים כדי לעורר פורפירינים. ספקטרום הפליטה של פורפירינים מציג בדרך כלל שיאים בטווח של 600-800 ננומטר18, מה שמביא לחפיפה ספקטרלית מועטה מאוד עם פלואורוסצאין איזותיוציאנט או פיקואריתרין (PE) פלואורופורים, אך חפיפה ניכרת עם פלואורופורים אחרים הנמצאים בשימוש לעתים קרובות, כגון אלופיקוציאנין (APC), כמו גם פלואורופורים טנדם, כגון PE-Cy5 ואחרים. לכן, בעת שימוש בפורפירינים במבחני ציטומטריה של זרימה מרובת צבעים, בקרות פלואורופור יחיד חיוניות כדי לתקן כראוי את זליגת הפלואורסצנטיות בתעלות אחרות מזו המיועדת למדוד את הפלואורסצנטיות של הפורפירין.
באופן אידיאלי, פקדי הפלואורופורים היחידים המשמשים לחישוב מטריצת הזליגה עבור פאנל של פלואורופורים (הנקראים גם “בקרות פיצוי”) צריכים להיות מורכבים מאותם סוגי תאים כמו הדגימה. עם זאת, שימוש במדגם למטרה זו אינו אופטימלי אם יש מדגם קטן מאוד מלכתחילה או אם אוכלוסיית היעד בתוך המדגם קטנה מאוד (למשל, אם רוצים להסתכל על מחלה שיורית מינימלית או תאים סרטניים בשלבים המוקדמים של המחלה). חלופה שימושית לתאים היא חרוזים יחד עם אותו פלואורופור המשמש לניתוח הדגימה. חרוזים רבים כאלה זמינים מסחרית; חרוזים אלה מסומנים מראש עם הפלואורופור הרצוי (חרוזים ספציפיים לפלואורופור מסומנים מראש)19,20, או שניתן להצמיד להם נוגדן מסומן פלואורסצנטית (חרוזי לכידת נוגדנים)20,21. בעוד חרוזי פיצוי מסחריים זמינים עבור פלואורופורים רבים, חרוזים כאלה אינם זמינים עבור פורפירינים, למרות השימוש הגובר בהם במחקר בסיסי וקליני.
בנוסף לשימור הדגימות ולגודל מתאים של אוכלוסיות חיוביות לעומת שליליות, היתרונות האחרים של שימוש בחרוזים כבקרות פיצוי הם קלות ההכנה, פלואורסצנטיות רקע נמוכה ויציבות מעולה לאורך זמן22. החיסרון הפוטנציאלי של שימוש בחרוזים כבקרת פיצוי הוא שספקטרום הפליטה של הנוגדן הפלואורסצנטי שנלכד על חרוזים עשוי להיות שונה מזה של אותו נוגדן המשמש לסימון התאים. זה עשוי להיות בעל חשיבות ספציפית בעת שימוש בציטומטר זרימה ספקטרלית20. לכן, פיתוח חרוזים כבקרת פיצוי צריך להתבצע על ציטומטר הזרימה שישמש לבדיקה שעבורה מפותחים החרוזים. יתר על כן, התפתחות החרוזים צריכה לכלול השוואה עם תאים המסומנים באותו מגיב צביעה פלואורסצנטי.
כאן, אנו מתארים את ההכנה של חרוזי פיצוי פוליסטירן פונקציונליים TCPP, שעוצמת הפלואורסצנטיות החציונית שלהם בתעלת הגילוי הייתה דומה לזו של תאים המסומנים ב- TCPP בכיח, והשימוש בהם כבקרות פיצוי עבור ציטומטריית זרימה. האוטופלואורסצנטיות של חרוזים שווי ערך, לא פונקציונליים, הייתה נמוכה מספיק לשימוש בהם כבקרות פיצוי פלואורסצנטיות שליליות. בנוסף, חרוזים אלה הפגינו יציבות באחסון במשך כמעט שנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות היישומים הרבים של פורפירינים באבחון סרטן וטיפולים2, קיימת ספרות מוגבלת על השימוש הפוטנציאלי שלהם כמגיב ציטומטרי זרימה לזיהוי אוכלוסיות תאים סרטניים לעומת לא סרטניים ברקמות אנושיות ראשוניות24,25,26. המחקר שלנו על ניתוח צ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לדיוויד רודריגז על הסיוע בהכנת הדמויות ושירותי הפתולוגיה המדויקת (סן אנטוניו, טקסס) על השימוש בציטומטר הזרימה Navios EX שלה.
Materials
| Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene | Research Products International | ZC1028-500 | |
| Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead | Spherotech | APX-100-10 | Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead |
| Conical tubes, 50 mL, Falcon | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Centrifuge | with appropriate rotor | ||
| Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL | Fisher Scientific | 09-761-140 | |
| EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98% | Sigma | 03450-1G | CAS No: 25952-53-8 |
| FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1) | BD | ||
| Glass coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-540-BP | |
| Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter) | Thomas Scientific | 1190M60 | |
| Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
| Isopropanol, ACS grade | Fisher Scientific | AC423830010 | |
| Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips | Eppendorf | 3123000918 | |
| MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt | Sigma | M0164 | CAS No: 117961-21-4 |
| Navios EX flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software | Olympus | or similar | |
| Pasteur pipettes, glass, 5.75" | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| pH meter (UB 10 Ultra Basic) | Denver Instruments | ||
| Pipette controller (Drummond) | Pipete.com | DP101 | |
| Plastic Syringe, 5 mL | Fisher Scientific | 14955452 | |
| Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO, 2.5% w/v, 8.0-12.9 µm | Spherotech | PP-100-10 | |
| Polypropylene tubes, 15mL, conical | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Polystyrene tubes, round bottom | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) | Fisher Scientific | NC9207381 | |
| Serological pipettes, disposable – 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Serological pipettes, disposable – 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-576 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S6014 | CAS No: 144-55-8 |
| TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine) Frontier Scientific | Fisher Scientific | 50-393-68 | CAS No: 14609-54-2 |
| Tecan Spark Plate Reader (or similar) | Tecan Life Sciences | ||
| Tube revolver/rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 |
References
- Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics. Theranostics. 2 (9), 916-966 (2012).
- Tsolekile, N., Nelana, S., Oluwafemi, O. S. Porphyrin as diagnostic and therapeutic agent. Molecules. 24 (14), 2669 (2019).
- Gunaydin, G., Gedik, M. E., Ayan, S. Photodynamic therapy for the treatment and diagnosis of cancer-A review of the current clinical status. Frontiers in Chemistry. 9, 686303 (2021).
- Berg, K., et al. Porphyrin-related photosensitizers for cancer imaging and therapeutic applications. Journal of Microscopy. 218, 133-147 (2005).
- Kessel, D., Reiners, J. Light-activated pharmaceuticals: Mechanisms and detection). Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 674-680 (2012).
- Didamson, O. C., Abrahamse, H. Targeted photodynamic diagnosis and therapy for esophageal cancer: Potential role of functionalized nanomedicine. Pharmaceutics. 13 (11), 1943 (2021).
- Harada, Y., Murayama, Y., Takamatsu, T., Otsuji, E., Tanaka, H. 5-Aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX fluorescence imaging for tumor detection: Recent advances and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6478 (2022).
- Bochenek, K., Aebisher, D., Międzybrodzka, A., Cieślar, G., Kawczyk-Krupka, A. Methods for bladder cancer diagnosis – The role of autofluorescence and photodynamic diagnosis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 141-148 (2019).
- Iwaki, K., et al. Flow cytometry-based photodynamic diagnosis with 5-aminolevulinic acid for the detection of minimal residual disease in multiple myeloma. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 249 (1), 19-28 (2019).
- Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
- Pan, L., et al. A brief introduction to porphyrin compounds used in tumor imaging and therapies. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 21 (11), 1303-1313 (2021).
- Nishida, K., Tojo, T., Kondo, T., Yuasa, M. Evaluation of the correlation between porphyrin accumulation in cancer cells and functional positions for application as a drug carrier. Scientific Reports. 11 (1), 2046 (2021).
- Lin, Y., Zhou, T., Bai, R., Xie, Y. Chemical approaches for the enhancement of porphyrin skeleton-based photodynamic therapy. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 35 (1), 1080-1099 (2020).
- Kou, J., Dou, D., Yang, L. Porphyrin photosensitizers in photodynamic therapy and its applications. Oncotarget. 8 (46), 81591-81603 (2017).
- Wezgowiec, J., et al. Electric field-assisted delivery of photofrin to human breast carcinoma cells. The Journal of Membrane Biology. 246 (10), 725-735 (2013).
- Palasuberniam, P., et al. Small molecule kinase inhibitors enhance aminolevulinic acid-mediated protoporphyrin IX fluorescence and PDT response in triple negative breast cancer cell lines. Journal of Biomedical Optics. 26 (9), 098002 (2021).
- Kim, B., Bohandy, J. Spectroscopy of porphyrins. Johns Hopkins APL Technical Digest. 2 (3), 153-163 (1981).
- Uttamlal, M., Sheila Holmes-Smith, A. The excitation wavelength dependent fluorescence of porphyrins. Chemical Physics Letters. 454 (4), 223-228 (2008).
- Zhang, Y. Z., Kemper, C., Bakke, A., Haugland, R. P. Novel flow cytometry compensation standards: internally stained fluorescent microspheres with matched emission spectra and long-term stability. Cytometry. 33 (2), 244-248 (1998).
- Monard, S. Building a spectral cytometry toolbox: Coupling fluorescent proteins and antibodies to microspheres. Cytometry. Part A. 101 (10), 846-855 (2022).
- Byrd, T., et al. Polystyrene microspheres enable 10-color compensation for immunophenotyping of primary human leukocytes. Cytometry. Part A. 87 (11), 1038-1046 (2015).
- Roederer, M. Compensation in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2002).
- Kabe, Y., et al. Porphyrin accumulation in mitochondria is mediated by 2-oxoglutarate carrier. The Journal of Biological Chemistry. 281 (42), 31729-31735 (2006).
- Bederka, L. H., et al. Sputum analysis by flow cytometry; An effective platform to analyze the lung environment. PLoS One. 17 (8), e0272069 (2022).
- . US6838248B2 – Compositions and methods for detecting pre-cancerous conditions in cell and tissue samples using 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxyphenyl) porphine Available from: https://patents.google.com/patent/US68248B2/en?oq=US+patent+6838248+B2 (2005)
- . Method of using 5,10,15,20-tetrakis(carboxyphenyl)porphine for detecting cancers of the lung Available from: https://www.osti.gov/deopatents/biblio/7117152 (1992)
- Grayson, M., et al. Quality-controlled sputum analysis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (174), e62785 (2021).
- Anjali, K., Christopher, J., Sakthivel, A. Ruthenium-based macromolecules as potential catalysts in homogeneous and heterogeneous phases for the utilization of carbon dioxide. ACS Omega. 4 (8), 13454-13464 (2019).
- Yadav, R., et al. Recent advances in the preparation and applications of organo-functionalized porous materials. Chemistry. 15 (17), 2588-2621 (2020).
- . US7670799B2 – Method for making 5,10,15,10-tetrakis (carboxyphenyl) porphine (TCPP) solutions and composition compromising TCPP Available from: https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en (2023)
- Shimizu, N., et al. High-performance affinity beads for identifying drug receptors. Nature Biotechnology. 18 (8), 877-881 (2000).
- Anderson, G. W., Zimmerman, J. E., Callahan, F. M. The use of esters of N-hydroxysuccinimide in peptide synthesis. Journal of the American Chemical Society. 86 (9), 1839-1842 (1964).
- Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (2013).
- El-Faham, A., Albericio, F. Peptide coupling reagents, more than a letter soup. Chemical Reviews. 111 (11), 6557-6602 (2011).
- Hulspas, R., O’Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry Part B. 76 (6), 355-364 (2009).
- Hoffman, R. A. Standardization, calibration, and control in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2005).
- Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chemical Society Reviews. 40 (1), 340-362 (2011).
- Beharry, A. A. Next-generation photodynamic therapy: New probes for cancer imaging and treatment. Biochemistry. 57 (2), 173-174 (2018).
- El-Far, M., Pimstone, N. A comparative study of 28 porphyrins and their abilities to localize in mammary mouse carcinoma: Uroporphyrin I superior to hematoporphyrin derivative. Progress in Clinical and Biological Research. 170, 661-672 (1984).
