Akış sitometrisinde kompanzasyon kontrolleri olarak kullanılmak üzere porfirin modifiye edilmiş boncuklar
Summary
Protokol, akış sitometrisi için porfirin bazlı kompanzasyon boncuklarının, amin fonksiyonelleştirilmiş polistiren boncukların porfirin TCPP ve amid kuplajlı reaktif EDC ile reaksiyonu ile nasıl hazırlandığını açıklar. Partikül yan ürünlerini azaltmak için bir filtreleme prosedürü kullanılır.
Abstract
Akış sitometrisi, floresan ölçümlerine dayanarak çeşitli hücre popülasyonlarını hızla karakterize edebilir ve ölçebilir. Hücreler ilk önce bir veya daha fazla floresan reaktifi ile boyanır, her biri hücre yüzeyi antijen ekspresyonu gibi fenotipik özelliklerine göre hücrelere seçici olarak bağlanan farklı bir floresan molekülü (florofor) ile işlevselleştirilir. Hücrelere bağlı her reaktiften floresan yoğunluğu, belirli bir dalga boyu aralığını tespit eden kanallar kullanılarak akış sitometresinde ölçülebilir. Birden fazla florofor kullanıldığında, bireysel floroforlardan gelen ışık genellikle istenmeyen algılama kanallarına dökülür ve bu da kompanzasyon adı verilen bir işlemde floresan yoğunluğu verilerinde bir düzeltme gerektirir.
Kompanzasyon kontrol parçacıkları, tipik olarak tek bir florofora bağlı polimer boncuklar, bir hücre etiketleme deneyinde kullanılan her florofor için gereklidir. Akış sitometresinden gelen kompanzasyon parçacıklarından elde edilen veriler, floresan yoğunluğu ölçümlerine bir düzeltme uygulamak için kullanılır. Bu protokol, floresan reaktif mezo-tetra (4-karboksifenil) porfin (TCPP) ile kovalent olarak işlevselleştirilmiş polistiren kompanzasyon boncuklarının hazırlanması ve saflaştırılmasını ve bunların akış sitometri kompanzasyonunda uygulanmasını açıklamaktadır. Bu çalışmada, amin fonksiyonelleştirilmiş polistiren boncuklar, pH 6’da ve oda sıcaklığında 16 saat boyunca ajitasyon ile TCPP ve amid kuplajlı reaktif EDC (N-(3-dimetilaminopropil)-N′-etilkarbodiimid hidroklorür) ile muamele edilmiştir. TCPP boncukları santrifüjleme ile izole edildi ve depolama için bir pH 7 tamponunda yeniden askıya alındı. TCPP ile ilişkili partiküller bir yan ürün olarak gözlendi. Bu partiküllerin sayısı, isteğe bağlı bir filtreleme protokolü kullanılarak azaltılabilir. Elde edilen TCPP boncukları, çoklu floroforlarla etiketlenmiş insan balgam hücreleri ile yapılan deneylerde telafi için bir akış sitometresinde başarıyla kullanıldı. TCPP boncukları, 300 gün boyunca buzdolabında saklandıktan sonra stabil olduğunu kanıtladı.
Introduction
Porfirinler, floresan ve tümör hedefleme özellikleri nedeniyle biyomedikal alanda uzun yıllardır ilgi görmektedir 1,2,3. Fotodinamik terapi (PDT) ve sonodinamik terapi (SDT) gibi terapötik uygulamalar, bir kanser hastasına sistematik olarak porfirin uygulanmasını, ilacın tümörde birikmesini ve tümörün belirli bir dalga boyundaki veya ultrasonun lazer ışığına lokalize maruz kalmasını gerektirir. Lazer ışığına veya ultrasona maruz kalmak, porfirin tarafından reaktif oksijen türlerinin üretilmesine ve ardından hücre ölümüne yol açar 4,5. Fotodinamik tanıda (PDD), kanser hücrelerini normal hücrelerden ayırmak için porfirin floresan kullanılır6. Bu bağlamda, öncülü 5-aminolevülinik asidin (5-ALA) sistemik veya lokal enjeksiyonu üzerine tümörlerde biriken doğal bir floresan porfirin olan protoporfirin IX, gastrointestinal stromal tümörleri, mesane kanserini ve beyin kanserini tanımlamak için kullanılır 7,8. Daha yakın zamanlarda, 5-ALA tedavisi, multipl miyelom9’da minimal rezidüel hastalığı tespit etmek için bir yaklaşım olarak araştırılmıştır. Laboratuvarımız tetraaril porfirin TCPP’yi (5,10,15,20-tetrakis-(4-karboksifenil)-21,23 H-porfin) insan balgam örneklerinde akciğer kanseri hücrelerini ve kanserle ilişkili hücreleri seçici olarak boyama kabiliyeti için kullanmaktadır ve bu özellik slayt tabanlı ve akış sitometrik tanı tahlillerinde kullanılmaktadır10.
Bazı porfirinler, terapötik ve tanısal ajanlar olarak kullanılabilmeleri açısından iki işlevlidir 2,11. Biyomedikal araştırmalarda, bu tür iki işlevli porfirinler, kanser hücrelerini seçici olarak hedefleme ve öldürme yeteneklerinin yapılarının bir fonksiyonu olduğunu ve diğer bileşiklerin varlığından nasıl etkilendiğini değerlendirmek için kullanılır 12,13,14,15,16. Porfirinlerin hem hücresel alımı hem de sitotoksisitesi, bir akış sitometrik platformunda yüksek verimli bir şekilde ölçülebilir. Floresan porfirinlerin absorpsiyon ve emisyon spektrumları karmaşıktır, ancak çoğu akış sitometrik platformu bunları doğru bir şekilde tanımlamak için donatılmıştır. Floresan porfirinlerin absorpsiyon spektrumu, Soret bandı olarak bilinen 380-500 nm aralığında güçlü bir absorpsiyon bandı ile karakterize edilir. İki ila dört zayıf absorpsiyon bandı genellikle 500-750 nm aralığında (Q bantları) gözlenir17. Çoğu akış sitometresinde bulunan mavi bir 488 nm lazer veya bir mor lazer (405 nm), porfirinleri uyarmak için uygun dalga boyunda ışık üretebilir. Porfirinlerin emisyon spektrumları tipik olarak 600-800 nm aralığında pikler gösterir18, bu da floresein izotiyosiyanat veya fikoeritrin (PE) floroforlarla çok az spektral örtüşme ile sonuçlanır, ancak allophycocyanin (APC) gibi diğer sık kullanılan floroforların yanı sıra PE-Cy5 ve diğerleri gibi tandem floroforlarla önemli ölçüde örtüşür. Bu nedenle, çok renkli akış sitometri tahlillerinde porfirinler kullanıldığında, porfirinin floresansını ölçmek için belirlenenden başka kanallarda floresan yayılımını yeterince düzeltmek için tek florofor kontrolleri gereklidir.
İdeal olarak, bir florofor paneli için yayılma matrisini hesaplamak için kullanılan tek florofor kontrolleri (“kompanzasyon kontrolleri” olarak da adlandırılır), numune ile aynı hücre tiplerinden oluşmalıdır. Bununla birlikte, numunenin bu amaçla kullanılması, başlamak için çok az örnek varsa veya numune içindeki hedef popülasyon çok küçükse (örneğin, hastalığın erken evrelerinde minimal kalıntı hastalığa veya kanser hücrelerine bakmak istiyorsa) optimal değildir. Hücrelere yararlı bir alternatif, numuneyi analiz etmek için kullanılan aynı florofor ile birleştirilmiş boncuklardır. Bu tür boncukların çoğu ticari olarak temin edilebilir; Bu boncuklar ya istenen florofor (önceden etiketlenmiş florofora özgü boncuklar)19,20 ile önceden etiketlenir ya da floresan olarak etiketlenmiş bir antikor bunlara bağlanabilir (antikor yakalama boncukları)20,21. Birçok florofor için ticari tazminat boncukları mevcut olsa da, bu tür boncuklar temel ve klinik araştırmalarda artan kullanımlarına rağmen porfirinler için mevcut değildir.
Numune koruma ve uygun büyüklükte pozitif ve negatif popülasyonlara ek olarak, boncukları kompanzasyon kontrolleri olarak kullanmanın diğer avantajları hazırlık kolaylığı, düşük arka plan floresansı ve zaman içinde mükemmel stabilitedir22. Boncukların bir kompanzasyon kontrolü olarak kullanılmasının potansiyel dezavantajı, boncuklar üzerinde yakalanan floresan antikorun emisyon spektrumunun, hücreleri etiketlemek için kullanılan aynı antikorunkinden farklı olabileceğidir. Bu, spektral akış sitometresi20 kullanıldığında özel bir öneme sahip olabilir. Bu nedenle, boncukların bir kompanzasyon kontrolü olarak geliştirilmesi, boncukların geliştirildiği tahlil için kullanılacak akış sitometresinde yapılmalıdır. Ayrıca, boncukların gelişimi, aynı floresan boyama reaktifi ile etiketlenmiş hücrelerle bir karşılaştırma içermelidir.
Burada, algılama kanalındaki medyan floresan yoğunluğu balgamdaki TCPP etiketli hücrelerinkiyle karşılaştırılabilir olan TCPP amin işlevli polistiren kompanzasyon boncuklarının hazırlanmasını ve akış sitometrisi için kompanzasyon kontrolleri olarak kullanımlarını açıklıyoruz. Eşdeğer, işlevsel olmayan boncukların otofloresansı, negatif floresan kompanzasyon kontrolleri olarak kullanımları için yeterince düşüktü. Ek olarak, bu boncuklar yaklaşık 1 yıl boyunca depolamada stabilite gösterdi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Porfirinlerin kanser tanı ve terapötiklerinde birçok uygulamasına rağmen2, primer insan dokularında kanserli ve kanserli olmayan hücre popülasyonlarının tanımlanmasında akış sitometrik reaktifi olarak potansiyel kullanımları hakkında sınırlı literatür vardır24,25,26. İnsan balgamının akış sitometrik analizi üzerine yaptığımızaraştırma 24,27</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
David Rodriguez’e, Navios EX akış sitometresinin kullanımı için şekil hazırlama ve Hassas Patoloji Hizmetleri (San Antonio, TX) ile ilgili yardımları için teşekkür ederiz.
Materials
| Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene | Research Products International | ZC1028-500 | |
| Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead | Spherotech | APX-100-10 | Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead |
| Conical tubes, 50 mL, Falcon | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Centrifuge | with appropriate rotor | ||
| Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL | Fisher Scientific | 09-761-140 | |
| EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98% | Sigma | 03450-1G | CAS No: 25952-53-8 |
| FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1) | BD | ||
| Glass coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-540-BP | |
| Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter) | Thomas Scientific | 1190M60 | |
| Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
| Isopropanol, ACS grade | Fisher Scientific | AC423830010 | |
| Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips | Eppendorf | 3123000918 | |
| MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt | Sigma | M0164 | CAS No: 117961-21-4 |
| Navios EX flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software | Olympus | or similar | |
| Pasteur pipettes, glass, 5.75" | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| pH meter (UB 10 Ultra Basic) | Denver Instruments | ||
| Pipette controller (Drummond) | Pipete.com | DP101 | |
| Plastic Syringe, 5 mL | Fisher Scientific | 14955452 | |
| Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO, 2.5% w/v, 8.0-12.9 µm | Spherotech | PP-100-10 | |
| Polypropylene tubes, 15mL, conical | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Polystyrene tubes, round bottom | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) | Fisher Scientific | NC9207381 | |
| Serological pipettes, disposable – 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Serological pipettes, disposable – 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-576 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S6014 | CAS No: 144-55-8 |
| TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine) Frontier Scientific | Fisher Scientific | 50-393-68 | CAS No: 14609-54-2 |
| Tecan Spark Plate Reader (or similar) | Tecan Life Sciences | ||
| Tube revolver/rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 |
References
- Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics. Theranostics. 2 (9), 916-966 (2012).
- Tsolekile, N., Nelana, S., Oluwafemi, O. S. Porphyrin as diagnostic and therapeutic agent. Molecules. 24 (14), 2669 (2019).
- Gunaydin, G., Gedik, M. E., Ayan, S. Photodynamic therapy for the treatment and diagnosis of cancer-A review of the current clinical status. Frontiers in Chemistry. 9, 686303 (2021).
- Berg, K., et al. Porphyrin-related photosensitizers for cancer imaging and therapeutic applications. Journal of Microscopy. 218, 133-147 (2005).
- Kessel, D., Reiners, J. Light-activated pharmaceuticals: Mechanisms and detection). Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 674-680 (2012).
- Didamson, O. C., Abrahamse, H. Targeted photodynamic diagnosis and therapy for esophageal cancer: Potential role of functionalized nanomedicine. Pharmaceutics. 13 (11), 1943 (2021).
- Harada, Y., Murayama, Y., Takamatsu, T., Otsuji, E., Tanaka, H. 5-Aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX fluorescence imaging for tumor detection: Recent advances and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6478 (2022).
- Bochenek, K., Aebisher, D., Międzybrodzka, A., Cieślar, G., Kawczyk-Krupka, A. Methods for bladder cancer diagnosis – The role of autofluorescence and photodynamic diagnosis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 141-148 (2019).
- Iwaki, K., et al. Flow cytometry-based photodynamic diagnosis with 5-aminolevulinic acid for the detection of minimal residual disease in multiple myeloma. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 249 (1), 19-28 (2019).
- Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
- Pan, L., et al. A brief introduction to porphyrin compounds used in tumor imaging and therapies. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 21 (11), 1303-1313 (2021).
- Nishida, K., Tojo, T., Kondo, T., Yuasa, M. Evaluation of the correlation between porphyrin accumulation in cancer cells and functional positions for application as a drug carrier. Scientific Reports. 11 (1), 2046 (2021).
- Lin, Y., Zhou, T., Bai, R., Xie, Y. Chemical approaches for the enhancement of porphyrin skeleton-based photodynamic therapy. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 35 (1), 1080-1099 (2020).
- Kou, J., Dou, D., Yang, L. Porphyrin photosensitizers in photodynamic therapy and its applications. Oncotarget. 8 (46), 81591-81603 (2017).
- Wezgowiec, J., et al. Electric field-assisted delivery of photofrin to human breast carcinoma cells. The Journal of Membrane Biology. 246 (10), 725-735 (2013).
- Palasuberniam, P., et al. Small molecule kinase inhibitors enhance aminolevulinic acid-mediated protoporphyrin IX fluorescence and PDT response in triple negative breast cancer cell lines. Journal of Biomedical Optics. 26 (9), 098002 (2021).
- Kim, B., Bohandy, J. Spectroscopy of porphyrins. Johns Hopkins APL Technical Digest. 2 (3), 153-163 (1981).
- Uttamlal, M., Sheila Holmes-Smith, A. The excitation wavelength dependent fluorescence of porphyrins. Chemical Physics Letters. 454 (4), 223-228 (2008).
- Zhang, Y. Z., Kemper, C., Bakke, A., Haugland, R. P. Novel flow cytometry compensation standards: internally stained fluorescent microspheres with matched emission spectra and long-term stability. Cytometry. 33 (2), 244-248 (1998).
- Monard, S. Building a spectral cytometry toolbox: Coupling fluorescent proteins and antibodies to microspheres. Cytometry. Part A. 101 (10), 846-855 (2022).
- Byrd, T., et al. Polystyrene microspheres enable 10-color compensation for immunophenotyping of primary human leukocytes. Cytometry. Part A. 87 (11), 1038-1046 (2015).
- Roederer, M. Compensation in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2002).
- Kabe, Y., et al. Porphyrin accumulation in mitochondria is mediated by 2-oxoglutarate carrier. The Journal of Biological Chemistry. 281 (42), 31729-31735 (2006).
- Bederka, L. H., et al. Sputum analysis by flow cytometry; An effective platform to analyze the lung environment. PLoS One. 17 (8), e0272069 (2022).
- . US6838248B2 – Compositions and methods for detecting pre-cancerous conditions in cell and tissue samples using 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxyphenyl) porphine Available from: https://patents.google.com/patent/US68248B2/en?oq=US+patent+6838248+B2 (2005)
- . Method of using 5,10,15,20-tetrakis(carboxyphenyl)porphine for detecting cancers of the lung Available from: https://www.osti.gov/deopatents/biblio/7117152 (1992)
- Grayson, M., et al. Quality-controlled sputum analysis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (174), e62785 (2021).
- Anjali, K., Christopher, J., Sakthivel, A. Ruthenium-based macromolecules as potential catalysts in homogeneous and heterogeneous phases for the utilization of carbon dioxide. ACS Omega. 4 (8), 13454-13464 (2019).
- Yadav, R., et al. Recent advances in the preparation and applications of organo-functionalized porous materials. Chemistry. 15 (17), 2588-2621 (2020).
- . US7670799B2 – Method for making 5,10,15,10-tetrakis (carboxyphenyl) porphine (TCPP) solutions and composition compromising TCPP Available from: https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en (2023)
- Shimizu, N., et al. High-performance affinity beads for identifying drug receptors. Nature Biotechnology. 18 (8), 877-881 (2000).
- Anderson, G. W., Zimmerman, J. E., Callahan, F. M. The use of esters of N-hydroxysuccinimide in peptide synthesis. Journal of the American Chemical Society. 86 (9), 1839-1842 (1964).
- Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (2013).
- El-Faham, A., Albericio, F. Peptide coupling reagents, more than a letter soup. Chemical Reviews. 111 (11), 6557-6602 (2011).
- Hulspas, R., O’Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry Part B. 76 (6), 355-364 (2009).
- Hoffman, R. A. Standardization, calibration, and control in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2005).
- Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chemical Society Reviews. 40 (1), 340-362 (2011).
- Beharry, A. A. Next-generation photodynamic therapy: New probes for cancer imaging and treatment. Biochemistry. 57 (2), 173-174 (2018).
- El-Far, M., Pimstone, N. A comparative study of 28 porphyrins and their abilities to localize in mammary mouse carcinoma: Uroporphyrin I superior to hematoporphyrin derivative. Progress in Clinical and Biological Research. 170, 661-672 (1984).
