Perles modifiées par la porphyrine utilisées comme témoins de compensation en cytométrie en flux

Les porphyrines intéressent depuis de nombreuses années le domaine biomédical en raison de leur fluorescence et de leurs propriétés de ciblage tumoral ^1,2,3. Les applications thérapeutiques telles que la thérapie photodynamique (PDT) et la thérapie sonodynamique (SDT) impliquent l’administration systémique d’une porphyrine à un patient cancéreux, l’accumulation du médicament dans la tumeur et l’exposition localisée de la tumeur à une lumière laser d’une longueur d’onde spécifique ou à des ultrasons. L’exposition à la lumière laser ou aux ultrasons conduit à la génération d’espèces réactives de l’oxygène par la porphyrine et à la mort cellulaire subséquente ^4,5. Dans le diagnostic photodynamique (TED), la fluorescence de la porphyrine est utilisée pour distinguer les cellules cancéreuses des cellules normales⁶. Dans ce contexte, la protoporphyrine IX, une porphyrine fluorescente naturelle qui s’accumule dans les tumeurs lors de l’injection systémique ou locale de son précurseur, l’acide 5-aminolévulinique (5-ALA), est utilisée pour identifier les tumeurs stromales gastro-intestinales, le cancer de la vessie et le cancer du cerveau ^7,8. Plus récemment, le traitement au 5-ALA a été exploré comme approche pour détecter une maladie résiduelle minimale dans le myélome multiple⁹. Notre laboratoire utilise la tétraarylporphyrine TCPP (5,10,15,20-tétrakis-(4-carboxyphényl)-21,23 H-porphine) pour sa capacité à colorer sélectivement les cellules cancéreuses du poumon et les cellules associées au cancer dans des échantillons d’expectorations humaines, une propriété qui a été exploitée dans les tests diagnostiques à base de lames et de cytométrie en flux¹⁰.

Certaines porphyrines sont bifonctionnelles en ce sens qu’elles peuvent être utilisées comme agents thérapeutiques et diagnostiques ^2,11. Dans la recherche biomédicale, ces porphyrines bifonctionnelles sont utilisées pour évaluer comment leur capacité à cibler sélectivement et à tuer les cellules cancéreuses est fonction de leur structure ainsi que la façon dont elle est affectée par la présence d’autres composés 12,13,14,15,16. L’absorption cellulaire des porphyrines et leur cytotoxicité peuvent être mesurées sur une plate-forme cytométrique en flux de manière à haut débit. Les spectres d’absorption et d’émission des porphyrines fluorescentes sont complexes, mais la plupart des plateformes cytométriques en flux sont équipées pour les identifier correctement. Le spectre d’absorption des porphyrines fluorescentes est caractérisé par une forte bande d’absorption comprise entre 380 et 500 nm, connue sous le nom de bande Soret. Deux à quatre bandes d’absorption plus faibles sont généralement observées dans la gamme 500-750 nm (bandes Q)¹⁷. Un laser bleu de 488 nm, présent dans la plupart des cytomètres en flux, ou un laser violet (405 nm) peut générer une lumière de la longueur d’onde appropriée pour exciter les porphyrines. Les spectres d’émission des porphyrines affichent généralement des pics compris entre 600 et 800 nm¹⁸, ce qui entraîne très peu de chevauchement spectral avec l’isothiocyanate de fluorescéine ou les fluorophores de phycoérythrine (PE), mais un chevauchement considérable avec d’autres fluorophores souvent utilisés, tels que l’allophycocyanine (APC), ainsi que des fluorophores en tandem, tels que PE-Cy5 et autres. Par conséquent, lors de l’utilisation de porphyrines dans des essais de cytométrie en flux multicolore, les contrôles monofluorophores sont essentiels pour corriger adéquatement le débordement de la fluorescence dans des canaux autres que celui désigné pour mesurer la fluorescence de la porphyrine.

Idéalement, les témoins monofluorophores utilisés pour calculer la matrice de débordement pour un panel de fluorophores (également appelés « témoins de compensation ») devraient être constitués du même type de cellule que l’échantillon. Cependant, l’utilisation de l’échantillon à cette fin n’est pas optimale s’il y a très peu d’échantillon au départ ou si la population cible au sein de l’échantillon est très petite (par exemple, si l’on veut examiner une maladie résiduelle minimale ou des cellules cancéreuses aux premiers stades de la maladie). Une alternative utile aux cellules est les billes couplées avec le même fluorophore qui est utilisé pour analyser l’échantillon. Beaucoup de ces perles sont disponibles dans le commerce; Ces billes sont soit prémarquées avec le fluorophore désiré (billes spécifiques du fluorophore prémarquées)^19,20, soit un anticorps marqué par fluorescence peut y être attaché (billes de capture d’anticorps)^20,21. Bien que des billes de compensation commerciales soient disponibles pour de nombreux fluorophores, de telles billes ne sont pas disponibles pour les porphyrines, malgré leur utilisation croissante dans la recherche fondamentale et clinique.

En plus de la préservation des échantillons et des populations positives par rapport aux populations négatives de taille appropriée, les autres avantages de l’utilisation de billes comme contrôles compensatoires sont la facilité de préparation, la faible fluorescence de fond et l’excellente stabilité dans le temps²². L’inconvénient potentiel de l’utilisation de billes comme contrôle de compensation est que le spectre d’émission de l’anticorps fluorescent capturé sur les billes peut différer de celui du même anticorps utilisé pour marquer les cellules. Cela peut être d’une importance particulière lors de l’utilisation d’un cytomètre spectral²⁰. Par conséquent, le développement de billes en tant que contrôle de compensation doit être effectué sur le cytomètre en flux qui sera utilisé pour le test pour lequel les billes sont développées. De plus, le développement des billes doit inclure une comparaison avec des cellules marquées avec le même réactif de coloration fluorescente.

Ici, nous décrivons la préparation de billes de compensation de polystyrène fonctionnalisées par amine TCPP, dont l’intensité médiane de fluorescence dans le canal de détection était comparable à celle des cellules marquées TCPP dans les expectorations, et leur utilisation comme contrôles de compensation pour la cytométrie en flux. L’autofluorescence des billes équivalentes non fonctionnalisées était suffisamment faible pour être utilisée comme témoins de compensation de fluorescence négative. De plus, ces billes ont démontré une stabilité en stockage pendant près de 1 an.