Porphyrin-modifizierte Beads zur Verwendung als Kompensationskontrollen in der Durchflusszytometrie

Porphyrine sind aufgrund ihrer Fluoreszenz- und Tumor-Targeting-Eigenschaften seit vielen Jahren im biomedizinischen Bereich von Interesse ^1,2,3. Therapeutische Anwendungen wie die photodynamische Therapie (PDT) und die sonodynamische Therapie (SDT) beinhalten die systemische Verabreichung eines Porphyrins an einen Krebspatienten, die Akkumulation des Medikaments im Tumor und die lokale Exposition des Tumors mit einem Laserlicht einer bestimmten Wellenlänge oder Ultraschall. Die Bestrahlung mit Laserlicht oder Ultraschall führt zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies durch das Porphyrin und in der Folge zum Zelltod ^4,5. In der photodynamischen Diagnostik (PDD) wird die Porphyrinfluoreszenz verwendet, um Krebszellen von normalen Zellen zu unterscheiden⁶. In diesem Zusammenhang wird Protoporphyrin IX, ein natürliches fluoreszierendes Porphyrin, das sich bei systemischer oder lokaler Injektion seiner Vorstufe, der 5-Aminolävulinsäure (5-ALA), in Tumoren anreichert, zur Identifizierung von gastrointestinalen Stromatumoren, Blasenkrebs und Hirntumoren verwendet ^7,8. In jüngerer Zeit wurde die 5-ALA-Behandlung als Ansatz zur Erkennung einer minimalen Resterkrankung beim Multiplen Myelom^{untersucht 9}. Unser Labor verwendet das Tetraarylporphyrin TCPP (5,10,15,20-tetrakis-(4-carboxyphenyl)-21,23 H-porphin) wegen seiner Fähigkeit, selektiv Lungenkrebszellen und krebsassoziierte Zellen in menschlichen Sputumproben zu färben, eine Eigenschaft, die in objektträgerbasierten und durchflusszytometrischen diagnostischen Assays ausgenutzt wurde¹⁰.

Einige Porphyrine sind insofern bifunktional, als sie als therapeutische und diagnostische Mittel eingesetzt werden können ^2,11. In der biomedizinischen Forschung werden solche bifunktionalen Porphyrine verwendet, um zu bewerten, wie ihre Fähigkeit, Krebszellen selektiv anzugreifen und abzutöten, von ihrer Struktur abhängt und wie sie durch das Vorhandensein anderer Verbindungen beeinflusst wird 12,13,14,15,16. Sowohl die zelluläre Aufnahme von Porphyrinen als auch ihre Zytotoxizität können auf einer durchflusszytometrischen Plattform im Hochdurchsatz gemessen werden. Die Absorptions- und Emissionsspektren von fluoreszierenden Porphyrinen sind komplex, aber die meisten durchflusszytometrischen Plattformen sind in der Lage, sie korrekt zu identifizieren. Das Absorptionsspektrum fluoreszierender Porphyrine zeichnet sich durch eine starke Absorptionsbande im Bereich von 380-500 nm aus, die als Soret-Bande bezeichnet wird. Zwei bis vier schwächere Absorptionsbanden werden im Allgemeinen im Bereich von 500-750 nm (Q-Banden) ^beobachtet17. Ein blauer 488-nm-Laser, der in den meisten Durchflusszytometern vorhanden ist, oder ein violetter Laser (405 nm) können Licht der entsprechenden Wellenlänge erzeugen, um Porphyrine anzuregen. Die Emissionsspektren von Porphyrinen zeigen typischerweise Spitzen im Bereich von 600-800 nm¹⁸, was zu einer sehr geringen spektralen Überlappung mit Fluoresceinisothiocyanat- oder Phycoerythrin (PE)-Fluorophoren, aber zu einer erheblichen Überlappung mit anderen häufig verwendeten Fluorophoren, wie Allophycocyanin (APC), sowie Tandem-Fluorophoren, wie PE-Cy5 und anderen, führt. Daher sind bei der Verwendung von Porphyrinen in mehrfarbigen Durchflusszytometrie-Assays Einzelfluorophorkontrollen unerlässlich, um den Spillover der Fluoreszenz in anderen Kanälen als dem, der für die Messung der Fluoreszenz des Porphyrins vorgesehen ist, angemessen zu korrigieren.

Idealerweise sollten die Einzelfluorophor-Kontrollen, die zur Berechnung der Spillover-Matrix für ein Panel von Fluorophoren verwendet werden (auch “Kompensationskontrollen” genannt), aus denselben Zelltypen wie die Probe bestehen. Die Verwendung der Probe für diesen Zweck ist jedoch nicht optimal, wenn es zunächst nur sehr wenige Proben gibt oder wenn die Zielpopulation innerhalb der Probe sehr klein ist (z. B. wenn man minimale Resterkrankungen oder Krebszellen in frühen Stadien der Krankheit betrachten möchte). Eine nützliche Alternative zu Zellen sind Beads, die mit demselben Fluorophor gekoppelt sind, der zur Analyse der Probe verwendet wird. Viele dieser Perlen sind im Handel erhältlich; Diese Beads sind entweder mit dem gewünschten Fluorophor vormarkiert (vormarkierte Fluorophor-spezifische Beads)^19,20, oder es kann ein fluoreszenzmarkierter Antikörper an sie angehängt werden (Antibody Capture Beads)^20,21. Während für viele Fluorophore kommerzielle Kompensationskügelchen zur Verfügung stehen, sind solche Beads für Porphyrine trotz ihres zunehmenden Einsatzes in der Grundlagen- und klinischen Forschung nicht verfügbar.

Neben der Probenkonservierung und der angemessenen Größe positiver und negativer Populationen sind die weiteren Vorteile der Verwendung von Beads als Kompensationskontrollen die einfache Präparation, die geringe Hintergrundfluoreszenz und die ausgezeichnete Stabilität über die Zeit²². Der potenzielle Nachteil der Verwendung von Beads als Kompensationskontrolle besteht darin, dass sich das Emissionsspektrum des fluoreszierenden Antikörpers, der auf Beads eingefangen wird, von dem desselben Antikörpers unterscheiden kann, der zur Markierung der Zellen verwendet wird. Dies kann bei Verwendung eines spektralen Durchflusszytometers²⁰ von besonderer Bedeutung sein. Daher muss die Entwicklung von Beads als Kompensationskontrolle auf dem Durchflusszytometer durchgeführt werden, das für den Assay verwendet wird, für den die Beads entwickelt werden. Darüber hinaus muss die Entwicklung der Kügelchen einen Vergleich mit Zellen beinhalten, die mit demselben fluoreszierenden Färbereagenz markiert sind.

In dieser Arbeit beschreiben wir die Herstellung von TCPP-Amin-funktionalisierten Polystyrol-Kompensationsbeads, deren mediane Fluoreszenzintensität im Detektionskanal mit der von TCPP-markierten Zellen im Sputum vergleichbar war, und deren Verwendung als Kompensationskontrollen für die Durchflusszytometrie. Die Autofluoreszenz von äquivalenten, nicht-funktionalisierten Beads war niedrig genug, um sie als negative Fluoreszenzkompensationskontrollen zu verwenden. Darüber hinaus zeigten diese Perlen eine Lagerstabilität von fast 1 Jahr.