Высокоэффективное разрушение генов в первичных макрофагах костного мозга с использованием электропорированных комплексов Cas9-sgRNA
Summary
Данный протокол описывает процедуру редактирования генома макрофагов костного мозга мышей с использованием рибонуклеопротеидных комплексов Cas9-sgRNA, собранных in vitro и доставленных методом электропорации.
Abstract
Макрофаги, полученные из костного мозга (BMDM) мышей, являются ключевым инструментом для изучения сложной биологии тканевых макрофагов. Будучи первичными клетками, они моделируют физиологию макрофагов in vivo более точно, чем иммортализированные клеточные линии макрофагов, и могут быть получены от мышей, уже несущих определенные генетические изменения. Тем не менее, нарушение функции генов в БМДМ остается технически сложной задачей. Здесь мы предлагаем протокол для эффективного редактирования генома CRISPR/Cas9 в BMDM, который позволяет вводить небольшие вставки и делеции (индели), которые приводят к мутациям со сдвигом фрейма, нарушающим функцию гена. Протокол описывает, как синтезировать однонаправляющие РНК (sgRNA-Cas9) и образовывать очищенные рибонуклеопротеидные комплексы (RNP) sgRNA-Cas9, которые могут быть доставлены с помощью электропорации. Он также предоставляет эффективный метод контроля эффективности редактирования с использованием рутинного секвенирования по Сэнгеру и свободно доступной онлайн-программы анализа. Протокол может быть выполнен в течение 1 недели и не требует построения плазмиды; Обычно это приводит к эффективности редактирования от 85% до 95%.
Introduction
Макрофаги являются клетками врожденного иммунитета, которые играют важнейшую роль в восстановлении тканей и иммунитете 1,2. Иммортализированные клеточные линии макрофагов, такие как мышиные клетки RAW 264.7 или клетки THP-1 человека, обладают несколькими полезными характеристиками, включая устойчивый рост и легкость разрушения генов за счет доставки векторов для РНК-интерференции или CRISPR/Cas9 3,4. Однако онкогенная трансформация резко изменяет их физиологию, что приводит к аберрантной активации одних путей и приглушенным реакциям других 5,6. Первичные макрофаги костного мозга (БМДМ) более точно повторяют физиологию макрофагов in vivo, но по-прежнему трудно поддаются генетическим манипуляциям из-за низкой эффективности как трансфекции плазмид, так и вирусной трансдукции в этих первичных иммунных клетках 7,8. Таким образом, необходимы более эффективные методы нарушения функции генов.
Редактирование генома CRISPR/Cas9 является мощным инструментом для генетических манипуляций в ряде биологических систем, включая клетки млекопитающих 9,10,11,12. Белок Streptococcus pyogenes Cas9 эффективно и специфически расщепляет двухцепочечную ДНК в комплексе с последовательно-специфичной направляющей РНК. Репарация ДНК через негомологичное концевое соединение (NHEJ) расщепленной ДНК приводит к небольшим вставкам или делециям (индел), которые создают мутации со сдвигом фрейма. В ранних исследованиях Cas9 и sgРНК доставлялись через плазмидные или лентивирусные векторы, которые являются эффективными методами доставки для многих клеточных линий 9,10. Однако первичные клетки и, в частности, первичные иммунные клетки часто невосприимчивы к этим методам из-за низкой эффективности доставки векторов путем трансфекции или трансдукции. Впоследствии были разработаны методы получения комплексов sgRNA-Cas9 in vitro и их доставки с помощью электропорации, и эти методы достигли высокой эффективности в различных типах клеток13,14. Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования данного подхода для редактирования генома первичных макрофагов.
В данной работе мы приводим протокол использования рибонуклеопротеиновых комплексов (РНП) sgRNA-Cas9 для редактирования генома в первичных МПДМ. Он содержит шаги по смягчению активации иммунных сенсоров, присутствующих в первичных иммунных клетках, и приводит к редактированию до 95% в целевых локусах с минимальной токсичностью. Этот протокол также включает в себя рабочие процессы для оценки эффективности редактирования с использованием рутинной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирования по Сэнгеру с последующим анализом in silico с помощью Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15, хорошо проверенного программного онлайн-инструмента.
Protocol
Representative Results
Discussion
Редактирование генома с использованием электропорированных комплексов Cas9-sgRNA позволяет эффективно нарушать функцию генов при МПДМ. Эффективность редактирования зависит от целевой последовательности и гена. Как правило, проводится скрининг от четырех до пяти сгРНК для выявления высо…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была профинансирована грантом NIH 5R01AI144149. Схематические фигуры были созданы с помощью BioRender.
Materials
| 3T3-MCSF Cell Line | Gift from Russell Vance | not applicable | |
| Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer | IDT | 1075915 | |
| Ampure XP Reagent Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | NEB | M0525S | |
| DNase | NEB | M0303S | |
| DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2) | Thermo Fisher | 14040-133 | |
| DPBS -Ca/Mg | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| ExoI | NEB | M0293S | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35-015-CV | |
| Herculase DNA polymerase & buffer | Agilent | 600677 | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2040S | |
| LoBind conical tubes 15 mL | Eppendorf | 30122216 | |
| LoBind Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf | 22431102 | |
| NEBuffer r2.1 | NEB | B6002S | |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher | MPK5000, MPP100, MPS100 | |
| Neon Transfection System 10 uL Tips | Thermo Fisher | MPK1025 or MPK1096 | |
| PBS + 1mM EDTA | Lonza | BE02017F | |
| Proteinase K | Thermo Fisher | EO0491 | |
| rCutSmart Buffer for ExoI | NEB | B6004S | |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0384 | |
| RNA loading dye | NEB | B0363S | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| S. pyogenes Cas9-NLS | University of California Macro Lab | not applicable | Available to non-UC investigators through https://qb3.berkeley.edu |
| S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation | IDT | 1081059 | |
| SAP | NEB | M0371S |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis, and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Paddison, P. J., Caudy, A. A., Hannon, G. J. Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (3), 1443-1448 (2002).
- Laugel, B., et al. Engineering of isogenic cells deficient for MR1 with a CRISPR/Cas9 lentiviral system: Tools to study microbial antigen processing and presentation to human MR1-restricted T cells. The Journal of Immunology. 197 (3), 971-982 (2016).
- Andreu, N., et al. Primary macrophages and J774 cells respond differently to infection with Mycobacterium tuberculosis. Scientific Reports. 7, 42225 (2017).
- Roberts, A. W., et al. Cas9+ conditionally-immortalized macrophages as a tool for bacterial pathogenesis and beyond. eLife. 8, e45957 (2019).
- Oberdoerffer, P., et al. Efficiency of RNA interference in the mouse hematopoietic system varies between cell types and developmental stages. Molecular and Cellular Biology. 25 (10), 3896-3905 (2005).
- Ma, S., et al. YTHDF2 orchestrates tumor-associated macrophage reprogramming and controls antitumor immunity through CD8+ T cells. Nature Immunology. 24 (2), 255-266 (2023).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, e00471 (2013).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).
- Craft, J. CRISPR-Cas9-mediated genome editing in primary murine bone marrow-derived macrophages. University of California, Davis. , (2022).
- Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mRNA. Journal of Visualized Experiments. (153), e60143 (2019).
- Yu, X., et al. Improved delivery of Cas9 protein/gRNA complexes using lipofectamine CRISPRMAX. Biotechnology Letters. 38 (6), 919-929 (2016).
