エレクトロポレーションCas9-sgRNA複合体を用いた初代骨髄由来マクロファージの高効率遺伝子破壊

マクロファージは、組織の修復と免疫に重要な役割を果たす自然免疫細胞です^1,2。マウスRAW 264.7細胞やヒトTHP-1細胞などの不死化マクロファージ細胞株は、RNA干渉またはCRISPR/Cas9 ^3,4用のベクターを送達することによる、堅牢な増殖や遺伝子破壊の容易さなど、いくつかの有益な特性を持っています。しかし、発がん性形質転換はそれらの生理機能を劇的に変化させ、その結果、いくつかの経路の異常な活性化と他の経路の応答の抑制が生じます^5,6。初代骨髄由来マクロファージ(BMDM)は、in vivoマクロファージの生理機能をより厳密に再現しているが、これらの初代免疫細胞におけるプラスミドトランスフェクションとウイルス形質導入の両方の効率が低いため、遺伝子操作は依然として困難である^7,8。したがって、遺伝子機能を破壊するためのより効率的な方法が必要です。

CRISPR/Cas9ゲノム編集は、哺乳類細胞を含むさまざまな生物学的システムにわたる遺伝子操作のための強力なツールである^9,10,11,12。化膿連鎖球菌Cas9タンパク質は、配列特異的なガイドRNAと複合体を形成すると、二本鎖DNAを効率的かつ特異的に切断します。切断されたDNAの非相同末端結合(NHEJ)によるDNA修復は、フレームシフト変異を引き起こす小さな挿入または欠失(インデル)をもたらします。初期の研究では、Cas9とsgRNAはプラスミドまたはレンチウイルスベクターを介して送達され、これらは多くの細胞株に効果的な送達方法である^9,10。しかし、初代細胞、特に初代免疫細胞は、トランスフェクションまたは形質導入によるベクター送達の効率が低いため、これらの方法に抵抗性を示すことがよくあります。その後、in vitroでsgRNA-Cas9複合体を作製し、エレクトロポレーションを介して送達する方法が開発され、これらの方法はさまざまな細胞タイプで高効率を達成しています^13,14。この結果は、このアプローチを用いて初代マクロファージのゲノム編集を行う可能性を示唆しています。

ここでは、sgRNA-Cas9リボ核タンパク質複合体(RNP)を使用して一次BMDMでゲノム編集を行うためのプロトコルを提供します。これには、初代免疫細胞に存在する免疫センサーの活性化を緩和する手順が含まれており、最小限の毒性で標的遺伝子座で最大95%の編集が可能です。このプロトコルには、ルーチンのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)およびサンガーシーケンシングを使用して編集効率を評価するワークフローも含まれており、その後、十分に検証されたオンラインソフトウェアツールである分解によるインデルの追跡(TIDE)¹⁵によるin silico分析が行われます。