Zeer efficiënte genverstoring in primaire beenmerg-afgeleide macrofagen met behulp van geëlektropoleerde Cas9-sgRNA-complexen
Summary
Dit protocol beschrijft de procedure voor genoombewerking in van beenmerg afgeleide macrofagen van muizen met behulp van Cas9-sgRNA ribonucleoproteïnecomplexen die in vitro zijn geassembleerd en door elektroporatie worden afgeleverd.
Abstract
Van beenmerg afgeleide macrofagen (BMDM’s) van muizen zijn een belangrijk hulpmiddel voor het bestuderen van de complexe biologie van weefselmacrofagen. Als primaire cellen modelleren ze de fysiologie van macrofagen in vivo nauwkeuriger dan onsterfelijke macrofaagcellijnen en kunnen ze worden afgeleid van muizen die al gedefinieerde genetische veranderingen dragen. Het verstoren van de genfunctie in BMDM’s blijft echter technisch uitdagend. Hier bieden we een protocol voor efficiënte CRISPR/Cas9-genoombewerking in BMDM’s, dat de introductie van kleine inserties en deleties (indels) mogelijk maakt die resulteren in frameshift-mutaties die de genfunctie verstoren. Het protocol beschrijft hoe single-guide RNA’s (sgRNA-Cas9) kunnen worden gesynthetiseerd en gezuiverde sgRNA-Cas9 ribonucleoproteïnecomplexen (RNP’s) kunnen worden gevormd die kunnen worden afgeleverd door elektroporatie. Het biedt ook een efficiënte methode voor het bewaken van de bewerkingsefficiëntie met behulp van routinematige Sanger-sequencing en een gratis beschikbaar online analyseprogramma. Het protocol kan binnen 1 week worden uitgevoerd en vereist geen plasmideconstructie; Het resulteert doorgaans in een bewerkingsefficiëntie van 85% tot 95%.
Introduction
Macrofagen zijn aangeboren immuuncellen die een cruciale rol spelen bij weefselherstel en immuniteit 1,2. Onsterfelijke macrofaagcellijnen, zoals RAW 264.7-cellen van muizen of menselijke THP-1-cellen, hebben verschillende gunstige eigenschappen, waaronder robuuste groei en gemakkelijke genverstoring door vectoren te leveren voor RNA-interferentie of CRISPR/Cas9 3,4. Oncogene transformatie verandert echter hun fysiologie drastisch, wat resulteert in de afwijkende activering van sommige paden en gedempte reacties van andere 5,6. Primaire beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDM’s) recapituleren nauwer in vivo macrofaagfysiologie, maar blijven een uitdaging om genetisch te manipuleren vanwege de lage efficiëntie van zowel plasmidetransfectie als virale transductie in deze primaire immuuncellen 7,8. Er zijn dus efficiëntere methoden nodig om de genfunctie te verstoren.
CRISPR/Cas9-genoombewerking is een krachtig hulpmiddel voor genetische manipulatie in een reeks biologische systemen, waaronder zoogdiercellen 9,10,11,12. Het Streptococcus pyogenes Cas9-eiwit splitst efficiënt en specifiek dubbelstrengs DNA wanneer het wordt gecomplexeerd met een sequentiespecifiek gids-RNA. DNA-reparatie door de niet-homologe eindverbinding (NHEJ) van het gespleten DNA resulteert in kleine inserties of deleties (indels) die frameshift-mutaties veroorzaken. In vroege studies werden Cas9 en sgRNA’s afgeleverd via plasmide- of lentivirale vectoren, die effectieve toedieningsmethoden zijn voor veel cellijnen 9,10. Primaire cellen en in het bijzonder primaire immuuncellen zijn echter vaak ongevoelig voor deze methoden vanwege de lage efficiëntie van vectorafgifte door transfectie of transductie. Vervolgens zijn methoden ontwikkeld om sgRNA-Cas9-complexen in vitro te genereren en deze via elektroporatie af te leveren, en deze methoden hebben een hoge efficiëntie bereikt in verschillende celtypen13,14. De resultaten suggereren de mogelijkheid om deze aanpak te gebruiken om genoombewerking uit te voeren in primaire macrofagen.
Hier bieden we een protocol voor het gebruik van sgRNA-Cas9 ribonucleoproteïnecomplexen (RNP’s) om genoombewerking uit te voeren in primaire BMDM’s. Het bevat stappen om de activering van de immuunsensoren die aanwezig zijn in primaire immuuncellen te verminderen en resulteert in tot 95% bewerking op gerichte loci met minimale toxiciteit. Dit protocol omvat ook workflows om de bewerkingsefficiëntie te evalueren met behulp van routinematige polymerasekettingreactie (PCR) en Sanger-sequencing, gevolgd door in silico-analyse door Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15, een goed gevalideerde online softwaretool.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genoombewerking met behulp van geëlektropoleerde Cas9-sgRNA-complexen maakt een effectieve verstoring van de genfunctie in BMDM’s mogelijk. De bewerkingsefficiëntie varieert afhankelijk van de doelsequentie en het gen. Doorgaans worden over het algemeen vier tot vijf sgRNA’s gescreend om er een te identificeren die zeer actief is. Sommige loci hebben een lagere bewerkingsefficiëntie, hoogstwaarschijnlijk vanwege de chromatinestructuur. In deze gevallen kunnen verschillende wijzigingen worden aangebracht om de bewerkin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de NIH-subsidie 5R01AI144149. De schematische figuren zijn gemaakt met BioRender.
Materials
| 3T3-MCSF Cell Line | Gift from Russell Vance | not applicable | |
| Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer | IDT | 1075915 | |
| Ampure XP Reagent Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | NEB | M0525S | |
| DNase | NEB | M0303S | |
| DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2) | Thermo Fisher | 14040-133 | |
| DPBS -Ca/Mg | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| ExoI | NEB | M0293S | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35-015-CV | |
| Herculase DNA polymerase & buffer | Agilent | 600677 | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2040S | |
| LoBind conical tubes 15 mL | Eppendorf | 30122216 | |
| LoBind Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf | 22431102 | |
| NEBuffer r2.1 | NEB | B6002S | |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher | MPK5000, MPP100, MPS100 | |
| Neon Transfection System 10 uL Tips | Thermo Fisher | MPK1025 or MPK1096 | |
| PBS + 1mM EDTA | Lonza | BE02017F | |
| Proteinase K | Thermo Fisher | EO0491 | |
| rCutSmart Buffer for ExoI | NEB | B6004S | |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0384 | |
| RNA loading dye | NEB | B0363S | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| S. pyogenes Cas9-NLS | University of California Macro Lab | not applicable | Available to non-UC investigators through https://qb3.berkeley.edu |
| S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation | IDT | 1081059 | |
| SAP | NEB | M0371S |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis, and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Paddison, P. J., Caudy, A. A., Hannon, G. J. Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (3), 1443-1448 (2002).
- Laugel, B., et al. Engineering of isogenic cells deficient for MR1 with a CRISPR/Cas9 lentiviral system: Tools to study microbial antigen processing and presentation to human MR1-restricted T cells. The Journal of Immunology. 197 (3), 971-982 (2016).
- Andreu, N., et al. Primary macrophages and J774 cells respond differently to infection with Mycobacterium tuberculosis. Scientific Reports. 7, 42225 (2017).
- Roberts, A. W., et al. Cas9+ conditionally-immortalized macrophages as a tool for bacterial pathogenesis and beyond. eLife. 8, e45957 (2019).
- Oberdoerffer, P., et al. Efficiency of RNA interference in the mouse hematopoietic system varies between cell types and developmental stages. Molecular and Cellular Biology. 25 (10), 3896-3905 (2005).
- Ma, S., et al. YTHDF2 orchestrates tumor-associated macrophage reprogramming and controls antitumor immunity through CD8+ T cells. Nature Immunology. 24 (2), 255-266 (2023).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, e00471 (2013).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).
- Craft, J. CRISPR-Cas9-mediated genome editing in primary murine bone marrow-derived macrophages. University of California, Davis. , (2022).
- Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mRNA. Journal of Visualized Experiments. (153), e60143 (2019).
- Yu, X., et al. Improved delivery of Cas9 protein/gRNA complexes using lipofectamine CRISPRMAX. Biotechnology Letters. 38 (6), 919-929 (2016).
