Ruptura Gênica de Alta Eficiência em Macrófagos Primários Derivados da Medula Óssea Usando Complexos Eletroporados Cas9-sgRNA
Summary
Este protocolo descreve o procedimento de edição do genoma em macrófagos derivados da medula óssea de camundongos usando complexos ribonucleoprotéicos Cas9-sgRNA montados in vitro e liberados por eletroporação.
Abstract
Macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) de camundongos são uma ferramenta chave para o estudo da complexa biologia de macrófagos teciduais. Como células primárias, elas modelam a fisiologia de macrófagos in vivo mais de perto do que linhagens celulares de macrófagos imortalizadas e podem ser derivadas de camundongos já portadores de alterações genéticas definidas. No entanto, a interrupção da função gênica em BMDMs permanece tecnicamente desafiadora. Aqui, fornecemos um protocolo para edição eficiente do genoma CRISPR/Cas9 em BMDMs, que permite a introdução de pequenas inserções e deleções (indels) que resultam em mutações frameshift que interrompem a função do gene. O protocolo descreve como sintetizar RNAs de guia único (sgRNA-Cas9) e formar complexos de ribonucleoproteínas (RNPs) purificados de sgRNA-Cas9 que podem ser liberados por eletroporação. Ele também fornece um método eficiente para monitorar a eficiência da edição usando o sequenciamento de rotina do Sanger e um programa de análise on-line disponível gratuitamente. O protocolo pode ser realizado em até 1 semana e não requer a construção de plasmídeos; normalmente resulta em 85% a 95% de eficiência de edição.
Introduction
Os macrófagos são células imunes inatas que desempenham papéis críticos no reparo tecidual e na imunidade 1,2. Linhagens celulares de macrófagos imortalizadas, como células RAW 264.7 de camundongos ou células THP-1 humanas, têm várias características benéficas, incluindo crescimento robusto e facilidade de ruptura gênica por meio da entrega de vetores para interferência de RNA ou CRISPR/Cas9 3,4. Entretanto, a transformação oncogênica altera drasticamente sua fisiologia, o que resulta na ativação aberrante de algumas vias e respostas silenciadas deoutras5,6. Macrófagos primários derivados da medula óssea (BMDMs) recapitulam mais de perto a fisiologia de macrófagos in vivo, mas permanecem desafiadores para manipular geneticamente devido à baixa eficiência tanto da transfecção de plasmídios quanto da transdução viral nessas células imunesprimárias 7,8. Assim, métodos mais eficientes para interromper a função gênica são necessários.
A edição do genoma CRISPR/Cas9 é uma ferramenta poderosa para manipulação genética em uma variedade de sistemas biológicos, incluindo células de mamíferos 9,10,11,12. A proteína Cas9 do Streptococcus pyogenes cliva de forma eficiente e específica o DNA de fita dupla quando complexada com um RNA-guia específico de sequência. O reparo do DNA através da junção final não homóloga (NHEJ) do DNA clivado resulta em pequenas inserções ou deleções (indels) que criam mutações frameshift. Nos primeiros estudos, Cas9 e sgRNAs foram liberados através de vetores plasmidiais ou lentivirais, que são métodos de liberação eficazes para muitas linhagens celulares 9,10. No entanto, as células primárias e, em particular, as células imunes primárias são frequentemente refratárias a esses métodos devido à baixa eficiência da liberação do vetor por transfecção ou transdução. Posteriormente, métodos foram desenvolvidos para gerar complexos sgRNA-Cas9 in vitro e liberá-los via eletroporação, e esses métodos alcançaram alta eficiência em uma variedade de tipos celulares13,14. Os resultados sugerem a possibilidade de usar esta abordagem para realizar a edição do genoma em macrófagos primários.
Aqui, nós fornecemos um protocolo para o uso de complexos ribonucleoproteicos sgRNA-Cas9 (RNPs) para realizar a edição do genoma em BMDMs primárias. Ele contém etapas para mitigar a ativação dos sensores imunológicos presentes nas células imunes primárias e resulta em até 95% de edição em loci alvo com toxicidade mínima. Esse protocolo também inclui fluxos de trabalho para avaliar a eficiência de edição usando reação em cadeia da polimerase (PCR) de rotina e sequenciamento de Sanger, seguido de análise in silico por Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15, uma ferramenta de software on-line bem validada.
Protocol
Representative Results
Discussion
A edição do genoma usando complexos Cas9-sgRNA eletroporados permite a interrupção efetiva da função gênica em BMDMs. A eficiência de edição varia de acordo com a sequência alvo e o gene. Normalmente, quatro a cinco sgRNAs são geralmente rastreados para identificar um que é altamente ativo. Alguns loci têm menor eficiência de edição, provavelmente devido à estrutura da cromatina. Nesses casos, várias modificações podem ser feitas para aumentar a eficiência da edição. A co-entrega de dois sgRNAs at…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH grant 5R01AI144149. As figuras esquemáticas foram criadas com BioRender.
Materials
| 3T3-MCSF Cell Line | Gift from Russell Vance | not applicable | |
| Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer | IDT | 1075915 | |
| Ampure XP Reagent Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | NEB | M0525S | |
| DNase | NEB | M0303S | |
| DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2) | Thermo Fisher | 14040-133 | |
| DPBS -Ca/Mg | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| ExoI | NEB | M0293S | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35-015-CV | |
| Herculase DNA polymerase & buffer | Agilent | 600677 | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2040S | |
| LoBind conical tubes 15 mL | Eppendorf | 30122216 | |
| LoBind Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf | 22431102 | |
| NEBuffer r2.1 | NEB | B6002S | |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher | MPK5000, MPP100, MPS100 | |
| Neon Transfection System 10 uL Tips | Thermo Fisher | MPK1025 or MPK1096 | |
| PBS + 1mM EDTA | Lonza | BE02017F | |
| Proteinase K | Thermo Fisher | EO0491 | |
| rCutSmart Buffer for ExoI | NEB | B6004S | |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0384 | |
| RNA loading dye | NEB | B0363S | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| S. pyogenes Cas9-NLS | University of California Macro Lab | not applicable | Available to non-UC investigators through https://qb3.berkeley.edu |
| S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation | IDT | 1081059 | |
| SAP | NEB | M0371S |
References
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