Distruzione genica ad alta efficienza nei macrofagi primari derivati dal midollo osseo utilizzando complessi elettroporati Cas9-sgRNA
Summary
Questo protocollo descrive la procedura per l’editing del genoma nei macrofagi derivati dal midollo osseo di topo utilizzando complessi ribonucleoproteici Cas9-sgRNA assemblati in vitro e somministrati mediante elettroporazione.
Abstract
I macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) dei topi sono uno strumento chiave per studiare la complessa biologia dei macrofagi tissutali. Come cellule primarie, modellano la fisiologia dei macrofagi in vivo più da vicino rispetto alle linee cellulari di macrofagi immortalizzate e possono essere derivate da topi già portatori di cambiamenti genetici definiti. Tuttavia, l’interruzione della funzione genica nei BMDM rimane tecnicamente impegnativa. Qui, forniamo un protocollo per l’editing efficiente del genoma CRISPR/Cas9 nei BMDM, che consente l’introduzione di piccole inserzioni e delezioni (indel) che si traducono in mutazioni frameshift che interrompono la funzione genica. Il protocollo descrive come sintetizzare RNA a guida singola (sgRNA-Cas9) e formare complessi ribonucleoproteici (RNP) sgRNA-Cas9 purificati che possono essere rilasciati mediante elettroporazione. Fornisce inoltre un metodo efficiente per monitorare l’efficienza dell’editing utilizzando il sequenziamento Sanger di routine e un programma di analisi online disponibile gratuitamente. Il protocollo può essere eseguito entro 1 settimana e non richiede la costruzione di plasmidi; In genere si traduce in un’efficienza di editing dall’85% al 95%.
Introduction
I macrofagi sono cellule immunitarie innate che svolgono un ruolo fondamentale nella riparazione dei tessuti e nell’immunità 1,2. Le linee cellulari di macrofagi immortalizzate, come le cellule RAW 264.7 di topo o le cellule THP-1 umane, hanno diverse caratteristiche benefiche, tra cui una crescita robusta e la facilità di distruzione genica fornendo vettori per l’interferenza dell’RNA o CRISPR/Cas9 3,4. Tuttavia, la trasformazione oncogenica altera drammaticamente la loro fisiologia, il che si traduce nell’attivazione aberrante di alcune vie e nelle risposte attenuate di altre 5,6. I macrofagi primari derivati dal midollo osseo (BMDM) ricapitolano più da vicino la fisiologia dei macrofagi in vivo, ma rimangono difficili da manipolare geneticamente a causa della bassa efficienza sia della trasfezione plasmidica che della trasduzione virale in queste cellule immunitarie primarie 7,8. Pertanto, sono necessari metodi più efficienti per interrompere la funzione genica.
L’editing genomico CRISPR/Cas9 è un potente strumento per la manipolazione genetica in una vasta gamma di sistemi biologici, comprese le cellule di mammifero 9,10,11,12. La proteina Cas9 dello Streptococcus pyogenes scinde in modo efficiente e specifico il DNA a doppio filamento quando complessata con un RNA guida specifico per la sequenza. La riparazione del DNA attraverso l’unione non omologa (NHEJ) del DNA scisso provoca piccole inserzioni o delezioni (indel) che creano mutazioni frameshift. Nei primi studi, Cas9 e sgRNA sono stati veicolati attraverso vettori plasmidici o lentivirali, che sono metodi di somministrazione efficaci per molte linee cellulari 9,10. Tuttavia, le cellule primarie e, in particolare, le cellule immunitarie primarie sono spesso refrattarie a questi metodi a causa della bassa efficienza di rilascio del vettore per trasfezione o trasduzione. Successivamente, sono stati sviluppati metodi per generare complessi sgRNA-Cas9 in vitro e per veicolarli tramite elettroporazione, e questi metodi hanno raggiunto un’elevata efficienza in una varietà di tipi cellulari13,14. I risultati hanno suggerito la possibilità di utilizzare questo approccio per effettuare l’editing del genoma nei macrofagi primari.
Qui, forniamo un protocollo per l’utilizzo dei complessi ribonucleoproteici (RNP) sgRNA-Cas9 per effettuare l’editing del genoma nei BMDM primari. Contiene misure per mitigare l’attivazione dei sensori immunitari presenti nelle cellule immunitarie primarie e si traduce in un editing fino al 95% in loci mirati con una tossicità minima. Questo protocollo include anche flussi di lavoro per valutare l’efficienza dell’editing utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR) di routine e il sequenziamento Sanger, seguiti dall’analisi in silico mediante Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15, uno strumento software online ben convalidato.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’editing del genoma utilizzando complessi Cas9-sgRNA elettroporati consente un’efficace interruzione della funzione genica nei BMDM. L’efficienza di editing varia in base alla sequenza e al gene target. In genere, quattro o cinque sgRNA vengono generalmente sottoposti a screening per identificarne uno altamente attivo. Alcuni loci hanno un’efficienza di editing inferiore, molto probabilmente a causa della struttura della cromatina. In questi casi, è possibile apportare diverse modifiche per aumentare l’efficienza dell’…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione NIH 5R01AI144149. Le figure schematiche sono state create con BioRender.
Materials
| 3T3-MCSF Cell Line | Gift from Russell Vance | not applicable | |
| Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer | IDT | 1075915 | |
| Ampure XP Reagent Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | NEB | M0525S | |
| DNase | NEB | M0303S | |
| DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2) | Thermo Fisher | 14040-133 | |
| DPBS -Ca/Mg | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| ExoI | NEB | M0293S | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35-015-CV | |
| Herculase DNA polymerase & buffer | Agilent | 600677 | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2040S | |
| LoBind conical tubes 15 mL | Eppendorf | 30122216 | |
| LoBind Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf | 22431102 | |
| NEBuffer r2.1 | NEB | B6002S | |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher | MPK5000, MPP100, MPS100 | |
| Neon Transfection System 10 uL Tips | Thermo Fisher | MPK1025 or MPK1096 | |
| PBS + 1mM EDTA | Lonza | BE02017F | |
| Proteinase K | Thermo Fisher | EO0491 | |
| rCutSmart Buffer for ExoI | NEB | B6004S | |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0384 | |
| RNA loading dye | NEB | B0363S | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| S. pyogenes Cas9-NLS | University of California Macro Lab | not applicable | Available to non-UC investigators through https://qb3.berkeley.edu |
| S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation | IDT | 1081059 | |
| SAP | NEB | M0371S |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis, and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Paddison, P. J., Caudy, A. A., Hannon, G. J. Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (3), 1443-1448 (2002).
- Laugel, B., et al. Engineering of isogenic cells deficient for MR1 with a CRISPR/Cas9 lentiviral system: Tools to study microbial antigen processing and presentation to human MR1-restricted T cells. The Journal of Immunology. 197 (3), 971-982 (2016).
- Andreu, N., et al. Primary macrophages and J774 cells respond differently to infection with Mycobacterium tuberculosis. Scientific Reports. 7, 42225 (2017).
- Roberts, A. W., et al. Cas9+ conditionally-immortalized macrophages as a tool for bacterial pathogenesis and beyond. eLife. 8, e45957 (2019).
- Oberdoerffer, P., et al. Efficiency of RNA interference in the mouse hematopoietic system varies between cell types and developmental stages. Molecular and Cellular Biology. 25 (10), 3896-3905 (2005).
- Ma, S., et al. YTHDF2 orchestrates tumor-associated macrophage reprogramming and controls antitumor immunity through CD8+ T cells. Nature Immunology. 24 (2), 255-266 (2023).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, e00471 (2013).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).
- Craft, J. CRISPR-Cas9-mediated genome editing in primary murine bone marrow-derived macrophages. University of California, Davis. , (2022).
- Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mRNA. Journal of Visualized Experiments. (153), e60143 (2019).
- Yu, X., et al. Improved delivery of Cas9 protein/gRNA complexes using lipofectamine CRISPRMAX. Biotechnology Letters. 38 (6), 919-929 (2016).
