Summary

Perturbation génique à haute efficacité dans les macrophages primaires dérivés de la moelle osseuse à l’aide de complexes d’ARNsg Cas9-sgRNA électroporés

Published: August 04, 2023
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Summary

Ce protocole décrit la procédure d’édition du génome dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris à l’aide de complexes ribonucléoprotéiques Cas9-sgRNA assemblés in vitro et délivrés par électroporation.

Abstract

Les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM) provenant de souris sont un outil clé pour étudier la biologie complexe des macrophages tissulaires. En tant que cellules primaires, elles modélisent la physiologie des macrophages in vivo plus étroitement que les lignées cellulaires de macrophages immortalisées et peuvent être dérivées de souris déjà porteuses de modifications génétiques définies. Cependant, la perturbation de la fonction des gènes dans les BMDM reste techniquement difficile. Ici, nous fournissons un protocole pour l’édition efficace du génome CRISPR/Cas9 dans les BMDM, qui permet l’introduction de petites insertions et délétions (indels) qui entraînent des mutations de décalage de cadre qui perturbent la fonction des gènes. Le protocole décrit comment synthétiser des ARN à guide unique (ARNsg-Cas9) et former des complexes ribonucléoprotéiques (RNP) ARNsg-Cas9 purifiés qui peuvent être délivrés par électroporation. Il fournit également une méthode efficace pour surveiller l’efficacité de l’édition à l’aide du séquençage de routine de Sanger et d’un programme d’analyse en ligne disponible gratuitement. Le protocole peut être effectué en 1 semaine et ne nécessite pas de construction de plasmide ; Il en résulte généralement une efficacité d’édition de 85 % à 95 %.

Introduction

Les macrophages sont des cellules immunitaires innées qui jouent un rôle essentiel dans la réparation des tissus et l’immunité 1,2. Les lignées cellulaires de macrophages immortalisées, telles que les cellules RAW 264.7 de souris ou les cellules humaines THP-1, présentent plusieurs caractéristiques bénéfiques, notamment une croissance robuste et une facilité de perturbation génique en délivrant des vecteurs d’interférence ARN ou CRISPR/Cas9 3,4. Cependant, la transformation oncogénique modifie considérablement leur physiologie, ce qui se traduit par l’activation aberrante de certaines voies et des réponses atténuées d’autres 5,6. Les macrophages primaires dérivés de la moelle osseuse (BMDM) récapitulent plus étroitement la physiologie des macrophages in vivo, mais restent difficiles à manipuler génétiquement en raison de la faible efficacité de la transfection plasmidique et de la transduction virale dans ces cellules immunitaires primaires 7,8. Il est donc nécessaire de mettre au point des méthodes plus efficaces pour perturber la fonction des gènes.

L’édition du génome CRISPR/Cas9 est un outil puissant pour la manipulation génétique dans une gamme de systèmes biologiques, y compris les cellules de mammifères 9,10,11,12. La protéine Cas9 de Streptococcus pyogenes clive efficacement et spécifiquement l’ADN double brin lorsqu’elle est complexée avec un ARN guide spécifique à la séquence. La réparation de l’ADN par la jonction d’extrémité non homologue (NHEJ) de l’ADN clivé entraîne de petites insertions ou délétions (indels) qui créent des mutations de décalage de cadre. Dans les premières études, Cas9 et les ARNsg ont été administrés par des vecteurs plasmides ou lentiviraux, qui sont des méthodes d’administration efficaces pour de nombreuses lignées cellulaires 9,10. Cependant, les cellules primaires et, en particulier, les cellules immunitaires primaires sont souvent réfractaires à ces méthodes en raison de la faible efficacité de l’administration du vecteur par transfection ou transduction. Par la suite, des méthodes ont été développées pour générer des complexes ARNsg-Cas9 in vitro et les délivrer par électroporation, et ces méthodes ont atteint une grande efficacité dans une variété de types de cellules13,14. Les résultats ont suggéré la possibilité d’utiliser cette approche pour effectuer l’édition du génome dans les macrophages primaires.

Ici, nous fournissons un protocole pour l’utilisation des complexes ribonucléoprotéiques (RNP) sgRNA-Cas9 pour effectuer l’édition du génome dans les BMDM primaires. Il contient des mesures pour atténuer l’activation des capteurs immunitaires présents dans les cellules immunitaires primaires et permet d’éditer jusqu’à 95 % des loci ciblés avec une toxicité minimale. Ce protocole comprend également des flux de travail permettant d’évaluer l’efficacité de l’édition à l’aide de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) de routine et du séquençage de Sanger, suivis d’une analyse in silico par Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15, un outil logiciel en ligne bien validé.

Protocol

1. Conception de l’ARNsg REMARQUE : Cette étape décrit la sélection des séquences cibles et la conception des ARNsg. Il est utile de concevoir des guides qui se trouvent dans le premier grand exon codant, de sorte que toute protéine traduite soit perturbée tôt dans le cadre de lecture ouvert. Il est également utile de sélectionner des séquences cibles qui se trouvent dans le même exon, car cela rationalisera l’analyse de l’efficacité de l’édition (étape 6)….

Representative Results

Le modèle IVT est un produit PCR de 127 pb (Figure 1B). Le produit IVT pleine longueur est un ARN de 98 nt, qui migre de la même manière qu’un fragment d’ADN double brin de 70 pb (Figure 1C). Après électroporation, les cellules doivent être viables à >90 %, avec un nombre total de cellules de >70 % du nombre de cellules de départ. Le pool de cellules mutantes résultant devrait avoir un ensemble diversifié d’indels, com…

Discussion

L’édition du génome à l’aide de complexes d’ARNsg Cas9 électroporés permet de perturber efficacement la fonction des gènes dans les BMDM. L’efficacité de l’édition varie en fonction de la séquence cible et du gène. En règle générale, quatre à cinq ARNsg sont généralement criblés pour en identifier un qui est très actif. Certains loci ont une efficacité d’édition plus faible, probablement en raison de la structure de la chromatine. Dans ces cas, plusieurs modifications peuvent être apport?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par la subvention 5R01AI144149 du NIH. Les figures schématiques ont été créées avec BioRender.

Materials

3T3-MCSF Cell Line Gift from Russell Vance not applicable
Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer IDT 1075915
Ampure XP Reagent Beads Beckman Coulter A63880
Calf intestinal alkaline phosphatase NEB M0525S
DNase NEB M0303S
DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2) Thermo Fisher 14040-133
DPBS -Ca/Mg Thermo Fisher 14190-144
ExoI NEB M0293S
Fetal Calf Serum (FCS) Corning 35-015-CV
Herculase DNA polymerase & buffer Agilent 600677
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit NEB E2040S
LoBind conical tubes 15 mL Eppendorf 30122216
LoBind Eppendorf tubes 2 mL Eppendorf 22431102
NEBuffer r2.1 NEB B6002S
Neon Transfection System Thermo Fisher MPK5000, MPP100, MPS100
Neon Transfection System 10 uL Tips Thermo Fisher MPK1025 or MPK1096
PBS + 1mM EDTA Lonza BE02017F
Proteinase K Thermo Fisher EO0491
rCutSmart Buffer for ExoI NEB B6004S
Ribolock Thermo Fisher EO0384
RNA loading dye NEB B0363S
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
S. pyogenes Cas9-NLS University of California Macro Lab not applicable Available to non-UC investigators through  https://qb3.berkeley.edu
S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation IDT 1081059
SAP NEB M0371S

References

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Cite This Article
Craft, J., Truong, T., Penn, B. H. High-Efficiency Gene Disruption in Primary Bone Marrow-Derived Macrophages Using Electroporated Cas9-sgRNA Complexes. J. Vis. Exp. (198), e65264, doi:10.3791/65264 (2023).

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