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Biology

Isolement sans marquage en deux étapes des mitochondries pour améliorer la découverte et la quantification des protéines

Published: June 02, 2023
doi:
10.3791/65252
,
1Department of Immunobiology,University of Lausanne

Summary

Nous présentons un protocole en deux étapes pour l’isolement de mitochondries de haute qualité qui est compatible avec la découverte et la quantification des protéines à l’échelle du protéome. Notre protocole ne nécessite pas de génie génétique et convient donc à l’étude des mitochondries de toutes les cellules et tissus primaires.

Abstract

La plupart des processus physiologiques et pathologiques, du métabolisme central à la réponse immunitaire à la neurodégénérescence, impliquent les mitochondries. Le protéome mitochondrial est composé de plus de 1 000 protéines, et l’abondance de chacune peut varier dynamiquement en réponse à des stimuli externes ou au cours de la progression de la maladie. Ici, nous décrivons un protocole pour isoler des mitochondries de haute qualité à partir de cellules et de tissus primaires. La procédure en deux étapes comprend (1) l’homogénéisation mécanique et la centrifugation différentielle pour isoler les mitochondries brutes, et (2) la capture immunitaire sans marquage des mitochondries pour isoler les organites purs et éliminer les contaminants. Les protéines mitochondriales de chaque étape de purification sont analysées par spectrométrie de masse quantitative et les rendements d’enrichissement sont calculés, ce qui permet la découverte de nouvelles protéines mitochondriales par protéomique soustractive. Notre protocole fournit une approche sensible et complète pour étudier le contenu mitochondrial dans les lignées cellulaires, les cellules primaires et les tissus.

Introduction

Les mitochondries sont des organites complexes et dynamiques capables de détecter et de s’adapter aux besoins métaboliques de la cellule. Au cœur de la complexité du métabolisme cellulaire, les mitochondries agissent comme des centres métaboliques où convergent les réactions métaboliques des glucides, des protéines, des lipides, des acides nucléiques et des cofacteurs1. Ils servent également d’organites de signalisation pour les voies de la réponse immunitaire innée et en réponse aux changements dans les ions et les espèces réactivesde l’oxygène 2,3. À ce jour, environ 1 100 protéines ont été cartographiées aux mitochondries 4,5,6, mais nous pouvons supposer qu’il reste beaucoup d’autres à découvrir, en particulier celles exprimées uniquement dans certains types de cellules ou transitoirement dans des conditions environnementales spécifiques. Le développement de nouvelles approches pour quantifier les changements dans la composition mitochondriale dans les états métaboliques d’intérêt permettra d’accroître nos connaissances sur ces organites et de mettre en évidence de nouvelles pistes thérapeutiques pour les troubles caractérisés par un dysfonctionnement mitochondrial7.

Actuellement, différents protocoles d’isolation des mitochondries sont disponibles, avec des rendements et des niveaux de puretédifférents 8. Les approches basées sur la centrifugation sont les plus populaires, en raison de leur simplicité et de leur faible coût. Bien qu’elle convienne à la plupart des applications, la centrifugation différentielle présente l’inconvénient d’obtenir une pureté mitochondriale inférieure et de nécessiter de grandes quantités de matériau de départ lorsque des applications plus complexes basées sur le gradient de densité sont utilisées. Ces dernières années, de nouvelles méthodes d’isolement des mitochondries ont vu le jour, telles que la capture immunitaire par marquage (« MITO-IP »)9 et le tri des organites activés par fluorescence10. Bien que les deux procédures puissent générer des échantillons de haute pureté, la première nécessite un génie génétique pour marquer les mitochondries pour la purification par affinité, ce qui rend les protocoles incompatibles avec le matériel primaire provenant d’organismes non modifiés ou de donneurs humains. Pendant ce temps, ce dernier dépend de l’accès à la cytométrie en flux et aux instruments de tri. La combinaison de différentes méthodes d’isolation offre la promesse de générer des protocoles plus robustes et une pureté accrue.

Ici, nous présentons un nouveau protocole pour l’isolement des mitochondries basé sur la combinaison de deux méthodes existantes : (1) centrifugation différentielle pour isoler une fraction mitochondriale brute, et (2) capture immunitaire sans marquage des mitochondries avec des billes superparamagnétiques liées de manière covalente à des anticorps contre la translocase de la membrane mitochondriale externe 22 (Tomm22)11, une protéine mitochondriale omniprésente de la membrane externe (Figure 1). La procédure que nous décrivons est compatible avec la spectrométrie quantitative de masse protéique, et parce qu’elle est sans marquage et ne nécessite pas de manipulation génétique, elle peut être appliquée à un large éventail de modèles de recherche, des lignées cellulaires aux fluides corporels en passant par les tissus animaux entiers. De plus, l’utilisation de deux étapes dans le protocole permet l’utilisation de la protéomique soustractive 6,12 pour la découverte de nouvelles protéines mitochondriales et l’étude de leur expression.

Protocol

Les gants doivent être portés en tout temps et les étapes de culture cellulaire effectuées sous une hotte à flux laminaire. Les cellules sont maintenues dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO2. La recherche présentée dans ce protocole a été approuvée et réalisée conformément aux directives de l’Université de Lausanne et de la Suisse pour l’utilisation des animaux. 1. Culture de la lignée cellulaire de macrophages RAW264.7 Cultiver les cellules de macrophage RAW264.7 de souris dans le milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco avec une glycémie et une glutamine élevées complétées par du sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur à 5 % (HI-FBS) et 100 UI/ml de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine (P/S).REMARQUE: Pour isoler les mitochondries, une seule plaque confluente de 15 cm (environ 70 x 10 7 cellules RAW264.7) est suffisante. Maintenir les cellules RAW264.7 dans des plaques de culture tissulaire. Une densité initiale de semis de 1 x 105 cellules/ml conduit à une plaque confluente en 3 jours. Utiliser 25 mL de suspension cellulaire dans un milieu pour une plaque de 15 cm. Les cellules RAW264.7 ont un taux de division cellulaire élevé et doivent être divisées plus fréquemment que la plupart des lignées cellulaires. Détachement de cellules RAW264.7Aspirez le média et lavez les cellules une fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Pour une plaque de 15 cm, ajouter 8 mL de tampon de dissociation RAW chaud (270 mM de chlorure de potassium, 30 mM de citrate de sodium dihydraté enH2O, filtré stérile) et incuber les cellules à 37 °C pendant 5 min. Ajouter un volume équivalent de milieu aux plaques (dilution 1:1 du tampon de dissociation) et pipette pour détacher et homogénéiser les cellules. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique et centrifuger le tube à 300 x g pendant 3 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans un volume approprié de milieu (décrit à l’étape 1.1) pour le comptage cellulaire.REMARQUE: D’autres méthodes pour détacher les cellules RAW264.7 peuvent être utilisées, telles que la trypsine ou un grattoir de cellule. Cependant, ces méthodes sont plus dures pour les cellules et peuvent conduire à leur polarisation en macrophages de type M1 dans les jours suivant le détachement. 2. Isolement et culture de macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM) Remarque : Le protocole décrit ici est pour une seule souris et peut être mis à l’échelle pour plusieurs souris. Des protocoles détaillés pour l’isolement et la culture de la BMDM ont été décrits ailleurs13,14. Sacrifiez une souris C57BL/6 âgée de 8 à 12 semaines avec une forte dose de CO2.REMARQUE: Des souris mâles ou femelles peuvent être utilisées. Vaporisez la souris avec de l’éthanol à 75% pour la stériliser. Disséquer et recueillir les hanches, les fémurs et les tibias de la souris15. Pour recueillir la moelle osseuse des fémurs et des tibias, retirez l’extrémité de l’articulation du genou des deux os15. Récupérer la moelle osseuse des hanches en enlevant l’acétabule. Transférer les os dans un tube conique de 50 mL avec 4 mL de milieu BMDM maintenu sur la glace (DMEM avec une glycémie élevée et de la glutamine complété par 5% HI-FBS, P / S et 10 mM HEPES).REMARQUE : Il est important de conserver les os dans le milieu pour éviter le dessèchement de la moelle osseuse pendant la dissection. Ajouter 4 mL de PBS et 4 mL de média BMDM chaud dans deux puits différents d’une plaque de 6 puits. Transférer les os et le média du tube conique de 50 ml dans un puits vide de la plaque à 6 puits. À l’aide d’une paire de pinces, transférez les os dans le puits PBS pour les laver. Transférer les os dans le puits contenant le milieu BMDM chaud. Faites un trou de 1 à 2 mm de diamètre dans le fond de deux tubes de 0,5 mL avec la pince et placez-les dans un tube de 1,5 mL.REMARQUE: Il n’est pas nécessaire d’ajouter un média au tube pour cette étape rapide. Dans chaque tube de 0,5 mL, placer un fémur, un tibia et une hanche de manière à ce que la moelle osseuse des os exposés soit orientée vers le bas des tubes. Centrifuger les tubes à 13 000 x g pendant 1 min à température ambiante pour recueillir la moelle osseuse et les milieux restants à travers le trou du tube de 0,5 mL et dans le tube de 1,5 mL. Jeter les tubes de 0,5 mL avec les os. Resuspendre les pastilles de moelle osseuse dans un milieu BMDM et transférer dans un tube conique de 15 mL. Ajouter le support BMDM jusqu’à 10 ml. Placer une passoire cellulaire de 40 μm sur un tube conique de 50 ml et filtrer la suspension de moelle osseuse à travers celui-ci. Centrifuger la suspension filtrée à 300 x g pendant 5 min à température ambiante pour récupérer les cellules intactes et éliminer les petits débris de la suspension cellulaire. Préparer 70 mL de milieu BMDM complété par 50 ng/mL de facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF). Remettez la pastille en suspension dans 10 mL de média BMDM supplémenté en M-CSF. Ajouter 9 ml de média BMDM supplémenté en M-CSF à chacune des sept boîtes de Petri de 10 cm. Plaquer 1 mL de cellules (environ 1 x 107 cellules) dans chacune des sept boîtes de Petri de 10 cm. Homogénéiser la suspension cellulaire dans chaque plaque en pipitant soigneusement de haut en bas sur la plaque et transférer les plaques dans l’incubateur. Après 3 jours, ajouter 5 mL de milieu BMDM chaud additionné de 50 ng/mL de m-CSF dans chaque plaque. Après 3 jours (jour 6, après l’isolement de la moelle osseuse), vérifier l’adhérence et la différenciation de la BMDM par microscopie.REMARQUE: À ce stade, il est possible de procéder directement à l’isolement des mitochondries (étape 3). Alternativement, on peut replaquer le BMDM, ce qui permet de les traiter avec des cytokines et de petites molécules. Détachement des BMDMAspirer le média de chaque plaque et ajouter 7 mL de PBS froid additionné d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 5 mM. Incuber les cellules à 4 °C pendant 7-8 min. Détacher les BMDM en les pipetant soigneusement de haut en bas à l’aide d’une pipette de 10 mL. Regrouper les BMDM resuspendus des sept plaques dans un seul tube conique de 50 ml et centrifuger à 300 x g pendant 3 minutes à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 40 mL de milieu BMDM chaud pour le comptage cellulaire.REMARQUE: Entre 7-9 x 107 BMDM sont obtenus par souris. Un minimum de 6 x 107 BMDM pour l’isolement des mitochondries est recommandé pour la protéomique. Si vous le souhaitez, plaquez et traitez les BMDM en fonction de l’objectif expérimental. Si ce n’est pas le cas, passez directement à l’étape 3.3. 3. Préparation d’une fraction mitochondriale brute par centrifugation différentielle REMARQUE : Effectuez toutes les étapes de centrifugation à 4 °C. Deux centrifugeuses sont nécessaires, l’une avec un rotor pivotant et des adaptateurs pour tubes coniques ayant une force centrifuge relative d’au moins 300 x g, l’autre avec une force centrifuge relative d’au moins 21 000 x g convenant à des tubes de 1,5 mL. Lorsque vous utilisez des cellules adhérentes, utilisez un grattoir de cellules. Pour les cellules adhérentes, aspirer le média et ajouter 10 mL de PBS par plaque de 15 cm.REMARQUE: Le grattage des cellules dans PBS permet de les laver en même temps. Si les cellules sont déjà dans la suspension, passez directement à l’étape 3.3. Détacher les cellules à l’aide d’un grattoir de cellules et les regrouper dans un seul tube conique de 50 mL. Homogénéiser la suspension cellulaire en pipetant de haut en bas.REMARQUE: Les cellules peuvent être détachées à l’aide d’un grattoir de cellules, car c’est plus rapide et elles seront lysées peu de temps après. Pour chaque condition expérimentale, transférer 5% du volume de suspension cellulaire dans un tube de 1,5 mL et le centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes à température ambiante.REMARQUE: Lorsque vous utilisez des cellules de suspension, assurez-vous de laver les cellules une fois avec PBS avant, pour éliminer les contaminants possibles du support tels que FBS. Jetez le surnageant et conservez le granulé sur la glace.REMARQUE: Cela représentera la fraction « cellule totale » pour la protéomique. Centrifuger le reste des échantillons de l’étape 3.1 ou 3.2 à 300 x g pendant 5 min à température ambiante. Effectuez toutes les étapes suivantes sur la glace et en utilisant des tampons glacés. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 5 mL de tampon mitochondrial glacé (MB) (210 mM de mannitol, 70 mM de saccharose, 10 mM HEPES/NaOH [pH 7,4] et 1 mM d’EDTA). Récupérer les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Remettez en suspension la pastille de cellule dans 0,5 mL de Mo froid et transférez-la dans un tube de 1,5 mL.REMARQUE: Cette procédure donne une concentration cellulaire approximative de 1,5 x 10 8 cellules BMDM / ml ou 3 x 108 cellules RAW 264,7 / mL. À l’aide d’une seringue de 1 mL munie d’une aiguille de 25 G, homogénéiser la suspension cellulaire par 30 passages à travers l’aiguille (figure 1A). Ajouter 1 mL de Mo froid dans le tube et mélanger par inversion. Centrifuger la suspension cellulaire homogénéisée à 2 000 x g pendant 5 min à 4 °C. Transvaser 1 mL du surnageant dans un tube frais de 1,5 mL sur de la glace sans perturber la pastille de cellule. Remettez en suspension la pastille de cellule et homogénéisez-la à nouveau, comme à l’étape 3.7. Regrouper la pastille de cellule homogénéisée et le surnageant des deux étapes précédentes dans un seul tube de 1,5 mL et le centrifuger à 2 000 x g pendant 5 min à 4 °C.REMARQUE: À ce stade, la pastille contient principalement des noyaux et des cellules ininterrompues et est jetée. Le surnageant contient des débris cellulaires, du cytosol et des organites, y compris des mitochondries (Figure 1B). Répartir le surnageant sur quatre tubes de 1,5 mL.REMARQUE : La division du surnageant entre plusieurs tubes à ce stade améliore l’élimination des contaminants dans les étapes suivantes. Ajouter MB pour obtenir un volume final de 1 mL dans chacun des quatre tubes. Mélanger par inversion et centrifuger les tubes à 13 000 x g pendant 10 min à 4 °C.REMARQUE: Après cette étape, une pastille à deux couches est visible. La pastille inférieure, ferme et brune contient des mitochondries et est conservée pour une purification ultérieure (Figure 1C). La pastille supérieure, lâche, blanche contient d’autres structures cellulaires et peut être jetée. Effectuez cette étape avec soin. Retirez le surnageant avec autant de pastille supérieure blanche que possible. En pipetant doucement dessus, il est possible de remettre en suspension la pastille blanche puis de la jeter, laissant la pastille mitochondriale brune intacte. Gardez l’un des quatre tubes contenant la pastille mitochondriale sur de la glace. Cela représente la fraction « mitochondries brutes » pour la protéomique. Regrouper les trois autres pastilles dans un tube de 1,5 mL dans un volume final de 1 mL de MB. 4. Purification des mitochondries à base d’anticorps superparamagnétiques REMARQUE : Effectuez toutes les étapes suivantes dans une chambre froide à 4 °C. Transférer 1 mL de la préparation mitochondriale brute de l’étape 3.18 dans un tube conique de 15 mL et ajouter 7 mL de MB complété par 150 mM de NaCl (MB + NaCl).REMARQUE: L’ajout de NaCl améliore la liaison des anticorps et diminue la liaison non spécifique des contaminants aux billes et aux mitochondries. Ajouter 50 μL de billes Tomm22 à la suspension de mitochondries brutes de 8 mL (Figure 1D) et incuber le tube pendant 15 min à 4 °C sur une roue rotative à basse vitesse.REMARQUE: Les billes Tomm22 sont liées de manière covalente aux anticorps monoclonaux Tomm22 élevés chez la souris, couplés à des billes superparamagnétiques. Pendant ce temps, placez une colonne sur l’aimant. Équilibrez la colonne avec 8 mL de Mo + NaCl et jetez le flux. Après 15 minutes d’incubation à 4 °C de l’échantillon avec les billes Tomm22, transférer l’échantillon dans la colonne. Ignorez le flux.REMARQUE : Les mitochondries resteront attachées aux billes magnétiques dans la colonne (Figure 1E). Lavez la colonne trois fois avec 8 mL de Mo + NaCl. Retirez la colonne de l’aimant et placez-la dans un tube conique de 15 mL. Éluer les mitochondries en ajoutant 1,5 mL de MB + NaCl à la colonne et appliquer immédiatement un piston pour éluer les mitochondries purifiées dans le tube. Transférer les mitochondries éluées dans un tube de 1,5 mL et les centrifuger à 21 000 x g pendant 10 min à 4 °C.REMARQUE: Une pastille brune se formera. Celui-ci contient les mitochondries isolées et certaines des billes couplées aux anticorps (Figure 1F). Retirez soigneusement le surnageant de la pastille. La pastille représente la fraction « mitochondries pures » pour la protéomique. Ce granulé ainsi que les granulés des étapes 3.4 et 3.17 peuvent être stockés à -20 °C et sont prêts pour les applications en aval.

Representative Results

Trois échantillons avec des degrés croissants de pureté mitochondriale sont générés dans le présent protocole : les cellules totales, les mitochondries brutes (« mito-brutes ») et les mitochondries pures (« mito-pures ») (Figure 1). Nous avons validé la purification des mitochondries de la lignée cellulaire de macrophages RAW264.7 en chargeant des quantités égales de protéines de chaque fraction sur un gel et un immunobuvardage, et avons constaté que la citrate synthase mitochondriale (Cs) était enrichie à chaque étape de purification ; pendant ce temps, les protéines du cytosol (GAPDH), de la membrane plasmique (Na/K ATPase), du noyau (Lamin B), des lysosomes (Lamp1) et du réticulum endoplasmique (ER) (Pdi) ont progressivement disparu (Figure 2A). Des résultats similaires ont été obtenus à l’aide de BMDM. Pour une validation plus poussée de la pureté et de l’intégrité des mitochondries isolées, une microscopie électronique sur la fraction mitochondriale pure a été effectuée. Nous avons observé des mitochondries de forme ovale classique et des cristae intactes entourées de particules denses en électrons correspondant aux billes recouvertes d’anticorps (Figure 2B). Par conséquent, on peut conclure que notre protocole enrichit les mitochondries, épuise les autres composants cellulaires et maintient l’intégrité structurelle mitochondriale. Ensuite, une analyse protéome de chaque fraction par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC/MS) a été effectuée. Un total de 6 248 protéines dans l’extrait de cellules totales, dont 907 ont été précédemment annotées comme mitochondriales dans l’inventaire MitoCarta3.05, ont été identifiées. Après filtrage des protéines avec un seuil d’au moins deux peptides uniques, nous avons calculé un score d’enrichissement pour chaque protéine de chaque échantillon en fonction de leur intensité par rapport au total des cellules. Nous avons ensuite attribué les protéines à sept compartiments subcellulaires principaux: mitochondries, ER, lysosomes, appareil de Golgi, cytosquelette, noyau et cytosol, en utilisant Gene Ontology (GO)16,17 et MitoCarta3.05 comme références. Il est important de noter qu’un enrichissement moyen en protéines mitochondriales de plus de 10 fois et de plus de 20 fois dans les fractions mitochondriales brutes et pures, respectivement, a été observé (Figure 2C). En revanche, les composants des six autres compartiments cellulaires analysés ont été épuisés pendant la procédure de purification. Il convient de noter en particulier que dans la fraction brute des mitochondries, nous avons observé un enrichissement transitoire pour les protéines ER et lysosomales, deux classes de protéines contaminantes fréquemment présentes suivant des protocoles de centrifugation différentielle18. Cela était peut-être dû aux interactions organite-organite et à des coefficients de sédimentation similaires, en particulier pour les lysosomes, qui sont très abondants dans les macrophages19. Alors que les deux étaient pour la plupart épuisés après la capture immunitaire, nous avons détecté un petit signal pour les protéines des sites de contact ER-mitochondries dans la fraction mito-pure. Nous avons ensuite comparé directement l’abondance des protéines des cellules totales et des échantillons mito-purs et observé deux populations distinctes, correspondant à des protéines mitochondriales et non mitochondriales (Figure 2D). Alors que la grande majorité des protéines MitoCarta se sont regroupées, nous en avons trouvé quelques-unes (<5%) qui se sont regroupées avec des protéines non-MitoCarta. Ces protéines peuvent représenter (1) des protéines interagissant avec les mitochondries cytosoliques (une nouvelle catégorie annotée dans la version 3.0 de MitoCarta), (2) des protéines à double localisation ou (3) des protéines mal annotées. Inversement, nous avons trouvé quelques cas de protéines non-MitoCarta se regroupant avec des protéines mitochondriales. Bien que ces protéines puissent représenter des contaminants de la procédure d’isolement, elles peuvent également représenter des protéines qui n’ont pas été classées auparavant comme étant présentes dans les mitochondries. Pour étudier cette nouvelle classe de protéines mitochondriales potentielles, la protéomique soustractive, une approche qui s’est avérée utile pour la découverte de protéomes organellaires, y compris les mitochondries 6,12, a été utilisée. La protéomique soustractive suppose que les mitochondries devraient s’enrichir pendant les étapes de purification et que les contaminants devraient s’épuiser6. Par exemple, alors que les contaminants peuvent s’accumuler pendant la centrifugation différentielle (p. ex. en raison de propriétés de sédimentation similaires) ou pendant la capture immunitaire (p. ex., en raison de la liaison d’anticorps non spécifiques), seules les protéines mitochondriales de bonne foi devraient s’accumuler de manière significative dans les deux. Il est donc possible de filtrer les protéines qui ont été trouvées dans la fraction mitochondriale pure mais qui ont montré des modèles d’enrichissement incohérents. Dans le présent exemple avec des cellules RAW264.7, en fixant un seuil pour les peptides uniques de ≥1 pour les échantillons mito-bruts et mito-purs, et en utilisant des seuils stricts d’enrichissement, nous avons pu affiner la liste des protéomes mitochondriaux récupérés à partir de 1 127 protéines initialement trouvées dans la fraction mitochondriale brute après centrifugation différentielle, jusqu’à 481 protéines après le deuxième cycle de purification par immunosélection Tomm22. Le nombre réduit de protéines annotées MitoCarta dans la fraction mito-pure reflète la rigueur élevée appliquée pour la sélection. Fait intéressant, 70 des protéines présentes dans la fraction mito-pure n’étaient pas présentes dans l’inventaire MitoCarta3.0 (Figure 3A, B). Ces dernières protéines peuvent représenter de nouvelles protéines candidates mitochondriales potentielles, qui ne peuvent être exprimées que dans la lignée cellulaire de macrophages RAW264.7 et dans des cellules apparentées, et qui méritent des recherches plus approfondies. Figure 1 : Illustration du protocole d’isolement des mitochondries en deux étapes et sans marqueur. (A) Une suspension cellulaire est perturbée par une aiguille de 25 G. (B) Les noyaux et les cellules entières sont séparés par centrifugation à 2 000 x g et le surnageant est sauvé. (C) Les mitochondries brutes sont isolées par centrifugation différentielle du surnageant à 13 000 x g (mito-brut). (D) Les mitochondries brutes sont ensuite incubées avec des anticorps Tomm22 (Ab) liés de manière covalente à des billes superparamagnétiques. (E) Les complexes mitochondries-tomm22 anticorps-billes sont séparés des contaminants à l’aide de colonnes magnétiques et élués. (F) Les mitochondries pures sont collectées et concentrées par centrifugation (mito-pure). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Graphique 2. Résultats représentatifs de l’isolement des mitochondries à partir de deux sources de macrophages. (A) Analyse par immunotransfert protéique des cellules RAW264.7 (en haut) et BMDM (en bas) à l’aide d’anticorps dirigés contre la citrate synthase mitochondriale (Cs – mitochondries), la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (Gapdh – cytosol), la pompe sodium-potassium (Na/K ATPase – membrane plasmique), la lamine B (Lamin B – noyau), la protéine membranaire associée au lysosomal 1 (Lamp1 – lysosome) et la protéine disulfure-isomérase (Pdi – ER). (B) Microscopie électronique de mitochondries purifiées à partir de cellules RAW264.7. Les particules de haute densité entourant les mitochondries correspondent aux billes Tomm22 qui sont transportées avec des échantillons mito-purs après élution des colonnes. Barres d’échelle: 80 nm. (C) Scores d’enrichissement sur le total des cellules, mito-brut et mito-pur à partir de sept compartiments cellulaires dans les cellules RAW264.7. MitoCarta3.0 et GO ont été utilisés pour l’annotation des protéines et les scores moyens sont représentés. Abréviation : ER = réticulum endoplasmique. (D) Valeurs d’abondance des protéines (riBAQ) pour les protéines dans les cellules totales et les échantillons mito-purs de cellules RAW264.7. Les protéines MitoCarta3.0 sont représentées en orange. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Graphique 3. Découverte de nouvelles protéines mitochondriales à l’aide de la protéomique soustractive. (A) Stratégie protéomique soustractive pour la découverte de nouvelles protéines mitochondriales. Des seuils de sélection élevés (4x et 2x) sont appliqués pour minimiser la sélection des faux positifs. (B) Rendements d’enrichissement (pli des cellules totales) de nouvelles protéines candidates mitochondriales non annotées précédemment dans l’inventaire MitoCarta3.0. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Nous avons combiné la centrifugation différentielle et l’immunocapture pour obtenir une pureté améliorée pour l’isolement des mitochondries. Notre procédure permet d’accéder à du matériel primaire pour l’identification et la caractérisation de nouvelles protéines mitochondriales. Le protocole est simple et robuste, et peut être appliqué aux lignées cellulaires, aux cellules primaires et aux tissus sans nécessiter de modification génétique. Nous avons validé notre protocole par immunoblotting et analyses protéomiques sur des échantillons prélevés à différentes étapes de la procédure de purification.

Par rapport aux méthodes d’isolement unique, la combinaison d’étapes d’enrichissement de différentes natures – ici, centrifugation et marquage immunitaire – génère un protocole plus robuste pour isoler les mitochondries. En effet, alors que les protéines mitochondriales s’enrichissent dans les deux purifications, il est peu probable que les contaminants soient également enrichis après les deux étapes d’enrichissement. Bien qu’une pureté mitochondriale élevée puisse également être obtenue par ultracentrifugation à gradient de densité, cette approche nécessite une grande quantité de matière première et l’accès à une ultracentrifugeuse. Enfin, contrairement aux méthodes récentes basées sur l’isolement mitochondrial basé sur le marquage20, notre approche ne nécessite pas de modification génétique de l’échantillon, ce qui le rend approprié pour le matériel primaire de toute source.

Certaines considérations techniques et biologiques doivent être prises en compte dans la conception expérimentale lors de l’application de notre protocole. (1) La quantité de matière première est critique pour obtenir une quantité suffisante. Inévitablement, un petit nombre de mitochondries sera perdu lors de l’homogénéisation (étape 3.10), car toutes les cellules ne sont pas lysées, ou pendant les lavages à trois colonnes (étape 4.6). Bien que notre protocole se concentre sur la pureté plutôt que sur le rendement, l’efficacité de l’isolement des mitochondries, et donc leur rendement, n’a pas été mesurée ou optimisée. L’utilisation de plus de billes Tomm22 et de plus de colonnes devrait augmenter le rendement de récupération des mitochondries. Dans le même temps, une optimisation approfondie de l’étape d’homogénéisation peut également conduire à une amélioration du rendement mitochondrial. Ce protocole et les nombres de cellules initiaux que nous rapportons ici pour les cellules RAW264.7 et les BMDM sont adéquats pour la protéomique et peuvent être ajustés pour d’autres applications. Dans le cas des BMDM primaires, nous avons constaté qu’une seule souris était suffisante pour une répétition. Si nécessaire, la procédure peut être mise à l’échelle pour isoler les BMDM de plusieurs animaux, qui peuvent ensuite être mis en commun pour obtenir suffisamment de matériel. Le nombre de cellules peut être optimisé en fonction du type de cellule, de sa taille et de son contenu mitochondrial. (2) Tomm22 est exprimé sur les mitochondries de tous les types de cellules et de tissus21, mais son niveau d’expression peut varier. Par conséquent, lors de la conception d’une expérience pour comparer différentes conditions, il est important de s’assurer que les niveaux d’expression de Tomm22 sont comparables. De plus, en raison de l’expression omniprésente de Tomm22, il n’est pas possible d’étudier les protéines mitochondriales spécifiques du type cellulaire dans les tissus complexes. (3) Le temps nécessaire pour générer des mitochondries pures (environ 2,5 h) est incompatible avec une étude d’événements transitoires, tels que des modifications des profils métaboliques. Dans ce cas, nous recommandons la capture immunitaire directe basée sur le marqueur.9, qui permet également d’étudier les mitochondries spécifiques de type cellulaire in vivo20. (4) Bien que des études sur des mitochondries isolées obtenues à l’aide de billes marquées uniquement par anticorps Tomm22 aient montré une activité dans des tests fonctionnels11, il reste à déterminer si les mitochondries générées avec notre protocole sont compatibles avec les tests basés sur l’activité en aval. La coloration MitoTracker ou le perchlorate d’ester méthylique de tétraméthylrhodamine (TMRM), ou les mesures de respirométrie, sont des approches potentielles pour quantifier la fonctionnalité des mitochondries isolées22. (5) Après élution de l’échantillon « mito-pur » de la colonne, des billes Tomm22 seront présentes dans la fraction mitochondriale pure (Graphique 2B). Bien que nous n’ayons observé aucune interférence avec la digestion de la trypsine et la spectrométrie de masse des protéines, la présence de ces billes et des immunoglobulines doit être prise en considération dans d’autres applications en aval. L’anticorps Tomm22 est un anticorps monoclonal produit chez la souris23, et il est donc important de garder à l’esprit que, lors de l’utilisation d’anticorps secondaires contre des souris dans le transfert immunoblot, il générera des bandes non spécifiques à la taille des chaînes d’immunoglobulines. (6) L’homogénéisation complète de la suspension cellulaire est la clé d’une isolation réussie des mitochondries. Ici, nous utilisons une seringue avec une aiguille de 25 G pour lyser à la fois les cellules RAW264.7 et les BMDM. Cependant, selon le type de cellule et sa taille, d’autres méthodes d’homogénéisation mécanique, telles que l’utilisation d’un homogénéisateur Dounce, ou des approches plus contrôlées telles que les dispositifs d’homogénéisation de cellules, peuvent être plus appropriées. Des méthodes d’homogénéisation non mécaniques, telles que la sonication douce, peuvent également être envisagées. Les approches d’homogénéisation tissulaire sont discutées plus en détail dans d’autres études24,25. (7) Bien que la validation par immunoblot soit la méthode la plus simple et la moins coûteuse, ses résultats pourraient ne pas toujours correspondre à des changements au niveau de l’organite entier. C’est pourquoi nous recommandons d’utiliser la protéomique pour valider pleinement l’enrichissement ou l’épuisement des mitochondries et d’autres organites, respectivement.

Le protocole de purification des mitochondries en deux étapes décrit ici nous a permis de générer des échantillons séquentiels avec une pureté mitochondriale croissante, ce qui nous a permis de découvrir de nouvelles protéines mitochondriales candidates grâce à la protéomique soustractive12. Pour notre analyse, nous utilisons des seuils stricts pour sélectionner des protéines mitochondriales significativement enrichies, et bien que cela puisse ne pas permettre d’identifier certaines protéines mitochondriales connues (Figure 3A), le taux de faux positifs pour la découverte de nouvelles protéines mitochondriales est diminué. Néanmoins, il est important de souligner que toute protéine candidate révélée par notre protocole doit être validée par des approches orthogonales. Nous recommandons le marquage GFP carboxy-terminal ou l’utilisation d’anticorps contre la protéine endogène pour valider l’association avec les mitochondries soit au microscope, soit par des tests de protection contre la protéase.

L’application directe de notre méthode dans le cas de cellules et de tissus non modifiés offre un outil puissant pour étudier comment les mitochondries changent et s’adaptent à leur environnement dans des conditions saines et pathogènes. L’application de notre protocole à des lignées cellulaires, à des modèles de maladies animales, à des fluides humains et même à des biopsies chirurgicales peut s’avérer particulièrement utile pour améliorer notre compréhension des mitochondries et de leurs troubles associés.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Manfredo Quadroni, le Centre d’analyse des protéines et l’Unité de microscopie électronique de l’Université de Lausanne pour leur aide. Nous remercions également H.G. Sprenger, K. Maundrell et les membres du laboratoire Jourdain pour leurs conseils et leurs commentaires sur le manuscrit. Ces travaux ont été soutenus par la Fondation Pierre-Mercier pour la Science et le Fonds national suisse de la recherche scientifique (subvention projet 310030_200796).

Materials

1 mL syringe BD Plastipal 309628
25 G Needle BD Microlance 300400
40 µm cell strainer Corning 352340
Anti-TOM22 Microbeads, mouse Miltenyi Biotec 130-127-693
Cell scraper FisherScientific 11577692
DMEM, high glucose, GlutaMAX ThermoFisher 31966
Ethylenediaminetetraacetic acid FisherScientific BP-120-1
Fetal bovine serum Gibco 10270
HEPES BioConcept 5-31F00-H
LS columns and plungers Miltenyi Biotec 130-042-401
Macrophage colony-stimulating factor Immunotools 12343115 
Mannitol Sigma M4125
Sodium chloride Sigma 71380
Sucrose Sigma S1888
Penicillin/Streptomycin BioConcept 4-01F00-H
Petri dishes Corning BH93B-102
Phosphate-buffered saline 10X Eurobio Scientific CS3PBS01-01
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
Vi-CELL BLU Cell Viability Analyzer Beckman Coulter C19196
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References

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Blanco-Fernandez, J., Jourdain, A. A. Two-Step Tag-Free Isolation of Mitochondria for Improved Protein Discovery and Quantification. J. Vis. Exp. (196), e65252, doi:10.3791/65252 (2023).
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