Gelişmiş protein keşfi ve nicelleştirme için mitokondrinin iki aşamalı etiketsiz izolasyonu

Eldivenler her zaman giyilmeli ve hücre kültürü adımları laminer akış başlığı altında gerçekleştirilmelidir. Hücreler,% 5 CO2 içeren 37 ° C’lik bir inkübatörde tutulur. Bu protokolde sunulan araştırma, Lozan Üniversitesi ve İsviçre’nin hayvanların kullanımına ilişkin kılavuzlarına uygun olarak onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir. 1. RAW264.7 makrofaj hücre hattının kültürü Dulbecco’nun modifiye kartal besiyerinde (DMEM) farelerin makrofaj RAW264.7 hücrelerini,% 5 ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu (HI-FBS) ve 100 IU / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin (P / S) ile desteklenmiş yüksek glikoz ve glutamin ile büyütün.NOT: Mitokondrileri izole etmek için, tek bir 15 cm’lik bir konfluent plaka (yaklaşık 70 x 10 7 RAW264.7 hücre) yeterlidir. RAW264.7 hücrelerini doku kültürü plakalarında tutun. 1 x 105 hücre/mL’lik bir başlangıç tohumlama yoğunluğu, 3 gün içinde bir birleşik plakaya yol açar. 15 cm’lik bir plaka için ortamda 25 mL hücre süspansiyonu kullanın. RAW264.7 hücreleri yüksek hücre bölünme oranına sahiptir ve çoğu hücre hattından daha sık bölünmesi gerekir. RAW264.7 hücrelerini ayırmaOrtamı aspire edin ve hücreleri bir kez fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. 15 cm’lik bir plaka için, 8 mL sıcak RAW ayrışma tamponu (270 mM potasyum klorür,H2O’da30 mM sodyum sitrat dihidrat, steril filtrelenmiş) ekleyin ve hücreleri 5 dakika boyunca 37 ° C’de inkübe edin. Plakalara eşdeğer miktarda ortam ekleyin (ayrışma tamponunun 1:1 seyreltilmesi) ve hücreleri ayırmak ve homojenize etmek için pipet. Hücre süspansiyonunu konik bir tüpe aktarın ve tüpü oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g’de santrifüj edin. Süpernatantı aspire edin ve hücre sayımı için peleti uygun bir ortam hacminde (adım 1.1’de açıklanmıştır) yeniden askıya alın.NOT: RAW264.7 hücrelerini ayırmak için tripsin veya hücre kazıyıcı gibi başka yöntemler de kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yöntemler hücreler üzerinde daha serttir ve ayrılmayı takip eden günlerde M1 benzeri makrofajlara polarizasyonlarına yol açabilir. 2. Kemik iliği kaynaklı makrofajların (BMDM’ler) izolasyonu ve kültürü NOT: Burada açıklanan protokol tek bir fare içindir ve birden fazla fare için ölçeklendirilebilir. BMDM izolasyonu ve kültürü için ayrıntılı protokoller başka bir yerde tanımlanmıştır13,14. Yüksek dozda CO2 ile 8-12 haftalık bir C57BL/6 fareyi kurban edin.NOT: Erkek veya dişi fareler kullanılabilir. Sterilize etmek için fareye% 75 etanol püskürtün. Kalçaları, femurları ve tibiaları fareden disseke edin ve toplayın15. Kemik iliğini femurlardan ve tibiaslardan toplamak için, her iki kemiğin diz eklemi ucunu çıkarın15. Asetabulumu çıkararak kemik iliğini kalçalardan kurtarın. Kemikleri, buz üzerinde tutulan 4 mL BMDM ortamı ile 50 mL’lik bir konik tüpe aktarın (% 5 HI-FBS, P / S ve 10 mM HEPS ile desteklenmiş yüksek glikoz ve glutamin içeren DMEM).NOT: Diseksiyon sırasında kemik iliğinin kurumasını önlemek için kemiklerin ortamda tutulması önemlidir. 6 delikli bir plakanın iki farklı kuyucuğuna 4 mL PBS ve 4 mL sıcak BMDM ortamı ekleyin. Kemikleri ve ortamı 50 mL konik tüpten 6 delikli plakanın boş bir kuyucuğuna aktarın. Bir çift forseps kullanarak, kemikleri yıkamak için PBS’ye iyice aktarın. Kemikleri sıcak BMDM ortamı içeren kuyuya aktarın. Forseps ile iki adet 0,5 mL tüpün dibinde 1-2 mm çapında bir delik açın ve bunları 1,5 mL’lik bir tüpe yerleştirin.NOT: Bu hızlı adım için tüpe medya eklemek gerekli değildir. Her 0.5 mL’lik tüpte, maruz kalan kemiklerin kemik iliği tüplerin dibine bakacak şekilde bir femur, tibia ve kalça yerleştirin. Kemik iliğini ve artık ortamı 0,5 mL tüpün deliğinden ve 1,5 mL tüpün içine toplamak için tüpleri oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 13.000 x g’de santrifüj edin. 0.5 mL tüpleri kemiklerle birlikte atın. BMDM ortamındaki kemik iliği peletlerini yeniden askıya alın ve 15 mL’lik bir konik tüpe aktarın. 10 mL’ye kadar BMDM ortamı ekleyin. 50 mL’lik bir konik tüpe 40 μm’lik bir hücre süzgeci yerleştirin ve kemik iliği süspansiyonunu içinden filtreleyin. Bozulmamış hücreleri geri kazanmak ve hücre süspansiyonundaki küçük kalıntıları temizlemek için filtrelenmiş süspansiyonu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g’de santrifüj edin. 50 ng / mL makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ile desteklenmiş 70 mL BMDM ortamı hazırlayın. Peletin 10 mL M-CSF takviyeli BMDM ortamında yeniden askıya alınması. Yedi adet 10 cm’lik Petri kabının her birine 9 mL M-CSF takviyeli BMDM ortamı ekleyin. Yedi adet 10 cm’lik Petri kabının her birinde 1 mL hücre (yaklaşık 1 x 107 hücre) plakası. Plaka üzerinde dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleme yaparak her plakadaki hücre süspansiyonunu homojenize edin ve plakaları inkübatöre aktarın. 3 gün sonra, her plakaya 50 ng / mL M-CSF ile desteklenmiş 5 mL sıcak BMDM ortamı ekleyin. 3 gün sonra (6. gün, kemik iliği izolasyonundan sonra), BMDM’nin yapışmasını ve farklılaşmasını mikroskopi ile doğrulayın.NOT: Bu noktada, doğrudan mitokondri izolasyonuna geçmek mümkündür (adım 3). Alternatif olarak, sitokinler ve küçük moleküllerle tedavi edilmelerine izin veren BMDM’yi yeniden plakalayabiliriz. BMDM’lerin ayrılmasıOrtamı her plakadan aspire edin ve 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile desteklenmiş 7 mL soğuk PBS ekleyin. Hücreleri 4 ° C’de 7-8 dakika boyunca inkübe edin. BMDM’leri 10 mL’lik bir pipet kullanarak dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyerek ayırın. Yedi plakanın hepsinden askıya alınmış BMDM’leri tek bir 50 mL konik tüpte bir araya getirin ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g’de santrifüj. Süpernatantı aspire edin ve hücre sayımı için hücreleri 40 mL sıcak BMDM ortamında yeniden askıya alın.NOT: Fare başına 7-9 x 107 BMDM arasında elde edilir. Proteomikler için mitokondri izolasyonu için en az 6 x 107 BMDM önerilir. İstenirse, BMDM’leri deneysel hedefe göre plakalayın ve tedavi edin. Değilse, doğrudan adım 3.3’e geçin. 3. Diferansiyel santrifüjleme ile ham mitokondriyal fraksiyonun hazırlanması NOT: Tüm santrifüjleme adımlarını 4 °C’de gerçekleştirin. Biri en az 300 x g bağıl santrifüj kuvvetine sahip konik tüpler için bir salınım rotoru ve adaptörleri, diğeri 1,5 mL borular için uygun en az 21.000 x g bağıl santrifüj kuvvetine sahip iki santrifüj gereklidir. Yapışkan hücreleri kullanırken, bir hücre kazıyıcı kullanın. Yapışkan hücreler için, ortamı aspire edin ve 15 cm’lik plaka başına 10 mL PBS ekleyin.NOT: PBS’deki kazıma hücreleri, birinin aynı anda yıkanmasını sağlar. Hücreler zaten askıya alma aşamasındaysa, doğrudan adım 3.3’e geçin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri ayırın ve bunları tek bir 50 mL konik tüpte toplayın. Hücre süspansiyonunu yukarı ve aşağı pipetleyerek homojenize edin.NOT: Hücreler bir hücre kazıyıcı kullanılarak ayrılabilir, çünkü bu daha hızlıdır ve kısa bir süre sonra lize edilirler. Her deneysel durum için, hücre süspansiyon hacminin% 5’ini 1,5 mL’lik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g’de santrifüjleyin.NOT: Süspansiyon hücrelerini kullanırken, FBS gibi ortamlardan olası kirleticileri temizlemek için hücreleri daha önce PBS ile bir kez yıkadığınızdan emin olun. Supernatant’ı atın ve peleti buz üzerinde tutun.NOT: Bu, proteomikler için “toplam hücre” fraksiyonunu temsil edecektir. Adım 3.1 veya 3.2’deki numunelerin geri kalanını oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g’de santrifüj edin. Aşağıdaki tüm adımları buz üzerinde ve buz gibi soğuk tamponlar kullanarak gerçekleştirin. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 5 mL buz gibi soğuk mitokondri tamponunda (MB) (210 mM mannitol, 70 mM sakaroz, 10 mM HEPS / NaOH [pH 7.4] ve 1 mM EDTA) yeniden askıya alın. 4 °C’de 5 dakika boyunca 300 x g’de santrifüjleme ile hücreleri geri kazanın. Hücre peletini 0,5 mL soğuk MB’de tekrar askıya alın ve 1,5 mL’lik bir tüpe aktarın.NOT: Bu prosedür yaklaşık 1,5 x 10 8 BMDM hücre/mL veya 3 x 108 RAW264,7 hücre/mL hücre konsantrasyonu sağlar. 25 G iğne ile donatılmış 1 mL’lik bir şırınga kullanarak, hücre süspansiyonunu iğneden 30 pasajla homojenize edin (Şekil 1A). Tüpe 1 mL soğuk MB ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. Homojenize hücre süspansiyonunu 2.000 x g’de 4 °C’de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantın 1 mL’sini, hücre peletini rahatsız etmeden buz üzerinde taze bir 1.5 mL tüpe aktarın. Hücre peletini yeniden askıya alın ve adım 3.7’de olduğu gibi tekrar homojenize edin. Homojenize hücre peletini ve önceki iki adımdaki süpernatantı tek bir 1,5 mL tüpte toplayın ve 4 ° C’de 5 dakika boyunca 2.000 x g’de santrifüj edin.NOT: Bu noktada, pelet çoğunlukla çekirdek ve kırılmamış hücreler içerir ve atılır. Süpernatant, hücresel enkaz, sitosol ve mitokondri de dahil olmak üzere organeller içerir (Şekil 1B). Süpernatantı dört adet 1,5 mL tüp arasında bölün.NOT: Bu aşamada süpernatantın birden fazla tüp arasında bölünmesi, aşağıdaki adımlarda kirleticilerin uzaklaştırılmasını iyileştirir. Dört tüpün her birinde 1 mL’lik son bir hacim elde etmek için MB ekleyin. İnversiyon ile karıştırın ve tüpleri 13.000 x g’de 4 ° C’de 10 dakika boyunca santrifüj edin.NOT: Bu adımdan sonra, iki katmanlı bir pelet görülebilir. Alt, sert, kahverengi pelet mitokondri içerir ve daha fazla saflaştırma için tutulur (Şekil 1C). Üst, gevşek, beyaz pelet diğer hücresel yapıları içerir ve atılabilir. Bu adımı dikkatli bir şekilde gerçekleştirin. Süpernatantı mümkün olduğunca beyaz üst pelet ile çıkarın. Üzerine hafifçe pipetleme yaparak, beyaz peleti yeniden askıya almak ve daha sonra kahverengi mitokondriyal peleti bozulmadan bırakarak atmak mümkündür. Dört tüpten birini mitokondriyal pelet ile buz üzerinde tutun. Bu, proteomikler için “ham mitokondri” fraksiyonunu temsil eder. Diğer üç peleti 1,5 mL’lik bir tüpte 1 mL’lik bir MB’lık son hacimde bir araya getirin. 4. Mitokondrinin süperparamanyetik antikor bazlı saflaştırılması NOT: Soğuk bir odada 4 °C’de aşağıdaki adımların tümünü uygulayın. Ham mitokondriyal preparatın 1 mL’sini adım 3.18’den 15 mL’lik bir konik tüpe aktarın ve 150 mM NaCl (MB + NaCl) ile desteklenmiş 7 mL MB ekleyin.NOT: NaCl ilavesi antikor bağlanmasını iyileştirir ve kirleticilerin boncuklara ve mitokondriye spesifik olmayan bağlanmasını azaltır. 8 mL ham mitokondri süspansiyonuna 50 μL Tomm22 boncuk ekleyin (Şekil 1D) ve tüpü düşük hızda dönen bir tekerlek üzerinde 4 ° C’de 15 dakika boyunca inkübe edin.NOT: Tomm22 boncukları, süperparamanyetik boncuklara bağlanmış, farede yetiştirilen Tomm22 monoklonal antikorlarına kovalent olarak bağlanır. Bu arada, mıknatısın üzerine bir sütun yerleştirin. Sütunu 8 mL MB + NaCl ile dengeleyin ve akışı atın. Tomm22 boncukları ile numunenin 4 °C’sinde 15 dakikalık inkübasyonun ardından, numuneyi kolona aktarın. Akışı atın.NOT: Mitokondri, sütundaki manyetik boncuklara bağlı kalacaktır (Şekil 1E). Kolonu 8 mL MB + NaCl ile üç kez yıkayın. Kolonu mıknatıstan çıkarın ve 15 mL’lik bir konik tüpe yerleştirin. Kolona 1.5 mL MB + NaCl ekleyerek mitokondrileri temizleyin ve saflaştırılmış mitokondrileri tüpe sokmak için hemen bir piston uygulayın. Salınan mitokondrileri 1,5 mL’lik bir tüpe aktarın ve 4 ° C’de 10 dakika boyunca 21.000 x g’de santrifüj edin.NOT: Kahverengi bir pelet oluşacaktır. Bu, izole edilmiş mitokondrileri ve antikorla eşleşmiş boncukların bazılarını içerir (Şekil 1F). Süpernatantı peletten dikkatlice çıkarın. Pelet, proteomikler için “saf mitokondri” fraksiyonunu temsil eder. Bu pelet, 3.4 ve 3.17. basamaklardaki peletlerle birlikte -20 °C’de saklanabilir ve çıkış yönündeki uygulamalar için hazırdır.