我们提出了一个用于高质量线粒体分离的两步方案,该方案与蛋白质组规模的蛋白质发现和定量兼容。我们的协议不需要基因工程,因此适用于研究来自任何原代细胞和组织的线粒体。
大多数生理和疾病过程,从中枢代谢到对神经变性的免疫反应,都涉及线粒体。线粒体蛋白质组由1000多种蛋白质组成,每种蛋白质的丰度可以响应外部刺激或疾病进展而动态变化。在这里,我们描述了一种从原代细胞和组织中分离高质量线粒体的方案。两步程序包括(1)机械均质和差速离心以分离粗线粒体,以及(2)线粒体的无标签免疫捕获以分离纯细胞器并消除污染物。通过定量质谱分析每个纯化阶段的线粒体蛋白,并计算富集产量,从而通过减法蛋白质组学发现新的线粒体蛋白。我们的实验方案为研究细胞系、原代细胞和组织中的线粒体含量提供了一种灵敏而全面的方法。
线粒体是复杂而动态的细胞器,能够感知和适应细胞的代谢需求。线粒体是细胞代谢复杂性的核心,是碳水化合物、蛋白质、脂质、核酸和辅因子代谢反应汇聚的代谢枢纽1。它们还充当先天免疫反应途径的信号细胞器,并响应离子和活性氧的变化2,3。迄今为止,大约有1,100种蛋白质被映射到线粒体4,5,6,但我们可以假设还有更多的蛋白质有待发现,特别是那些仅在某些细胞类型中表达或在特定环境条件下短暂表达的蛋白质。开发量化感兴趣的代谢状态下线粒体组成变化的新方法将增加我们对这些细胞器的了解,并突出以线粒体功能障碍为特征的疾病的新治疗途径7。
目前,有不同的线粒体分离方案可用,具有不同的产量和纯度水平8。基于离心的方法因其简单性和低成本而最受欢迎。虽然适用于大多数应用,但当使用更复杂的基于密度梯度的应用时,差速离心的缺点是线粒体纯度较低,并且需要大量起始材料。近年来,出现了分离线粒体的新方法,例如基于标签的免疫捕获(“MITO-IP”)9 和荧光激活细胞器分选10。尽管这两种程序都可以生成高纯度的样品,但前者需要基因工程来标记线粒体以进行亲和纯化,这使得该方案与来自未改性生物体或人类供体的主要材料不兼容。同时,后者依赖于流式细胞术和分选仪器的可及性。结合不同的分离方法,有望产生更稳健的实验方案和更高的纯度。
在这里,我们提出了一种基于两种现有方法组合的线粒体分离新方案:(1)差异离心以分离粗线粒体部分,以及(2)线粒体的无标签免疫捕获,超顺磁珠与外线粒体膜22(Tomm22)11(一种无处不在的线粒体外膜蛋白)的转位酶抗体共价结合(图1).我们描述的程序与定量蛋白质质谱兼容,并且由于它是无标签的并且不需要遗传操作,因此可以应用于广泛的研究模型,从细胞系到体液再到整个动物组织。此外,在协议中使用两个步骤可以使用减法蛋白质组学6,12 来发现新的线粒体蛋白并研究其表达。
我们结合了差速离心和免疫捕获,以提高线粒体分离的纯度。我们的程序允许访问用于鉴定和表征新型线粒体蛋白的主要材料。该方案简单而稳健,可以应用于细胞系、原代细胞和组织,而无需进行基因改造。我们通过对整个纯化过程中不同阶段采集的样品进行免疫印迹和蛋白质组学分析来验证我们的方案。
与单一分离方法相比,不同性质的富集步骤(此处为离心和免疫标记)的组合可生成更强大的方案来分离线粒体。这是因为,虽然线粒体蛋白在两次纯化中都会富集,但在两次富集步骤后,污染物也不太可能富集。虽然密度梯度超速离心也可以实现高线粒体纯度,但这种方法需要大量的起始材料和超速离心机。最后,与最近基于基于标签的线粒体分离20的方法相比,我们的方法不需要对样品进行基因修饰,使其适用于任何来源的主要材料。
在应用我们的协议时,在实验设计中需要考虑一些技术和生物学因素。(1)起始材料的量对于获得足够的材料至关重要。不可避免地,在匀浆过程中(步骤3.10)会丢失少量线粒体,因为并非所有细胞都被裂解,或者在三柱洗涤期间(步骤4.6)。虽然我们的方案侧重于纯度而不是产量,但线粒体分离的效率及其产量尚未得到测量或优化。使用更多的Tomm22珠和更多的色谱柱有望提高线粒体回收率。同时,对均质化步骤进行彻底优化也可以提高线粒体产量。该协议以及我们在此处报告的RAW264.7细胞和BMDM的初始细胞数足以用于蛋白质组学,并且可以针对其他应用进行调整。在原代BMDM的情况下,我们发现一只小鼠足以进行一次复制。必要时,可以扩大该程序以从多种动物中分离BMDM,然后可以将其汇集以获得足够的材料。可以根据细胞类型、大小和线粒体含量优化细胞数量。(2)Tomm22在所有细胞类型和组织的线粒体上表达21,但其表达水平可能会有所不同。因此,在设计比较不同条件的实验时,重要的是要确保Tomm22的表达水平具有可比性。此外,由于Tomm22的普遍表达,不可能研究复杂组织中的细胞类型特异性线粒体蛋白。(3)产生纯线粒体所需的时间(约2.5小时)与瞬时事件的研究不相容,例如代谢谱的变化。在这种情况下,我们建议直接基于标签的免疫捕获9,这也允许研究细胞类型的特异性线粒体 in vivo20.(4)尽管单独使用Tomm22抗体标记的磁珠获得的分离线粒体的研究在功能测定中显示出活性11,还有待确定使用我们的协议生成的线粒体是否与下游基于活性的测定兼容。MitoTracker或四甲基罗丹明甲酯高氯酸盐(TMRM)染色或呼吸测量是量化分离线粒体功能的潜在方法22.(5)从色谱柱中洗脱“mito-pure”样品后,一些Tomm22珠将存在于纯线粒体部分(图2B).虽然我们观察到胰蛋白酶消化和蛋白质质谱没有干扰,但在其他下游应用中应考虑这些磁珠和免疫球蛋白的存在。Tomm22抗体是在小鼠体内产生的单克隆抗体23,因此重要的是要记住,当在免疫印迹中使用针对小鼠的二抗时,它将在免疫球蛋白链的大小上产生非特异性条带。(6)细胞悬液的完全均质化是成功分离线粒体的关键。在这里,我们使用带有25 G针头的注射器来裂解RAW264.7细胞和BMDM。然而,根据细胞类型及其大小,其他机械均质方法(例如使用Dounce均质器)或更受控的方法(例如细胞均质器设备)可能更合适。也可以考虑非机械均质方法,例如温和超声处理。组织均质化方法在其他研究中进一步讨论24,25.(7)尽管免疫印迹验证是最直接和更便宜的方法,但其结果可能并不总是与整个细胞器水平的变化相关。这就是为什么我们建议使用蛋白质组学来完全验证线粒体和其他细胞器的富集或消耗。
这里描述的两步线粒体纯化方案使我们能够生成线粒体纯度增加的顺序样品,这使我们能够通过减法蛋白质组学发现新的线粒体蛋白候选物12。对于我们的分析,我们使用严格的阈值来选择显着富集的线粒体蛋白,尽管这可能无法识别一些已知的线粒体蛋白(图3A),但新线粒体蛋白发现的假阳性率降低。然而,重要的是要强调,我们的协议揭示的任何候选蛋白质都必须通过正交方法进行验证。我们建议使用羧基末端GFP标记或使用针对内源性蛋白的抗体,以通过显微镜或蛋白酶保护测定验证与线粒体的关联。
在未修饰的细胞和组织的情况下直接应用我们的方法提供了一个强大的工具来研究线粒体在健康和疾病条件下如何改变和适应其环境。将我们的方案应用于细胞系,动物疾病模型,人体体液,甚至手术活检可能被证明对增强我们对线粒体及其相关疾病的理解特别有用。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢Manfredo Quadroni,蛋白质分析设施和洛桑大学的电子显微镜设施的帮助。我们还要感谢H.G. Sprenger,K. Maundrell和Jourdain实验室的成员对手稿的建议和反馈。这项工作得到了Pierre-Mercier pour la Science基金会和瑞士国家科学基金会(项目资助310030_200796)的支持。
1 mL syringe | BD Plastipal | 309628 | |
25 G Needle | BD Microlance | 300400 | |
40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
Anti-TOM22 Microbeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-127-693 | |
Cell scraper | FisherScientific | 11577692 | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX | ThermoFisher | 31966 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | FisherScientific | BP-120-1 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 10270 | |
HEPES | BioConcept | 5-31F00-H | |
LS columns and plungers | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
Macrophage colony-stimulating factor | Immunotools | 12343115 | |
Mannitol | Sigma | M4125 | |
Sodium chloride | Sigma | 71380 | |
Sucrose | Sigma | S1888 | |
Penicillin/Streptomycin | BioConcept | 4-01F00-H | |
Petri dishes | Corning | BH93B-102 | |
Phosphate-buffered saline 10X | Eurobio Scientific | CS3PBS01-01 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
Vi-CELL BLU Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | C19196 |