בידוד דו-שלבי ללא תגים של מיטוכונדריה לשיפור גילוי וכימות חלבונים

יש ללבוש כפפות בכל עת ולבצע צעדי תרבית תאים מתחת למכסה מנוע זרימה למינרית. התאים נשמרים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. המחקר המוצג בפרוטוקול זה אושר ובוצע בהתאם להנחיות אוניברסיטת לוזאן ושוויץ לשימוש בבעלי חיים. 1. תרבית של קו תאי מקרופאג RAW264.7 לגדל את המקרופאג’ RAW264.7 של עכברים במדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) עם גלוקוז וגלוטמין גבוהים בתוספת סרום בקר עוברי 5% מומת חום (HI-FBS) ו-100 IU/מ”ל פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ”ל סטרפטומיצין (P/S).הערה: כדי לבודד מיטוכונדריה, צלחת אחת בקוטר 15 ס”מ (בערך 70 x 107 תאים גולמיים 264.7) מספיקה. שמור על תאי RAW264.7 בלוחיות תרבית רקמה. צפיפות זריעה ראשונית של 1 x 105 תאים / מ”ל מובילה לצלחת מפגש תוך 3 ימים. השתמש 25 מ”ל של תרחיף התא במדיה עבור צלחת 15 ס”מ. לתאי RAW264.7 יש קצב חלוקת תאים גבוה ויש לפצל אותם בתדירות גבוהה יותר מרוב קווי התאים. ניתוק תאי RAW264.7שאפו את המדיה ושטפו את התאים פעם אחת במי מלח חוצצי פוספט (PBS). לקבלת צלחת בקוטר 15 ס”מ, הוסיפו 8 מ”ל של חיץ דיסוציאציה גולמי חם (270 מ”מ אשלגן כלורי, 30 מ”מ נתרן ציטראט דיהידרט ב-H2O, סטרילי מסונן) ודגרו על התאים ב-37°C למשך 5 דקות. הוסף נפח שווה ערך של מדיה ללוחות (דילול 1:1 של חיץ הדיסוציאציה), ופיפטה כדי לנתק ולהפוך את התאים להומוגניים. מעבירים את מתלה התא לצינור חרוטי וצנטריפוגות את הצינור ב 300 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה בנפח מתאים של מדיה (המתואר בשלב 1.1) לספירת תאים.הערה: ניתן להשתמש בשיטות אחרות לניתוק תאי RAW264.7, כגון טריפסין או מגרד תאים. עם זאת, שיטות אלה קשות יותר על התאים ועלולות להוביל לקיטוב שלהם למקרופאגים דמויי M1 בימים שלאחר הניתוק. 2. בידוד ותרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם (BMDM) הערה: הפרוטוקול המתואר כאן מיועד לעכבר יחיד וניתן להגדיל אותו עבור עכברים מרובים. פרוטוקולים מפורטים לבידוד ותרבות BMDM תוארו במקומות אחרים13,14. הקריבו עכבר C57BL/6 בן 8-12 שבועות עם מינון גבוה של CO2.הערה: ניתן להשתמש בעכברים זכרים או נקבות. רססו את העכבר באתנול 75% כדי לעקר אותו. נתחו ואספו את הירכיים, עצם הירך והטיביאס מהעכבר15. כדי לאסוף את מח העצם מן עצם הירך ואת tibias, להסיר את קצה מפרק הברך של שתי העצמות15. לשחזר מח עצם מן הירכיים על ידי הסרת acetabulum. מעבירים את העצמות לצינור חרוטי של 50 מ”ל עם 4 מ”ל של מדיה BMDM שנשמרת על קרח (DMEM עם גלוקוז גבוה וגלוטמין בתוספת 5% HI-FBS, P/S ו-10 mM HEPES).הערה: חשוב לשמור את העצמות במדיה כדי למנוע התייבשות של מח העצם במהלך דיסקציה. הוסף 4 מ”ל של PBS ו 4 מ”ל של מדיה BMDM חם בשתי בארות שונות של צלחת 6 בארות. מעבירים את העצמות ואת המדיה מצינור החרוטי 50 מ”ל לבאר ריקה של צלחת 6 בארות. באמצעות זוג מלקחיים, להעביר את העצמות PBS היטב כדי לשטוף אותם. מעבירים את העצמות לבאר המכילה מדיה BMDM חמה. צור חור בקוטר 1-2 מ”מ בתחתית שני צינורות 0.5 מ”ל עם המלקחיים והניחו אותם בצינור 1.5 מ”ל.הערה: אין צורך להוסיף מדיה לצינור עבור שלב מהיר זה. בכל צינור של 0.5 מ”ל, הניחו את עצם הירך, השוקה והירך באופן כזה שמח העצם של העצמות החשופות פונה לכיוון תחתית הצינורות. צנטריפוגה את הצינורות ב 13,000 x גרם במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את מח העצם ושאריות מדיה דרך החור של צינור 0.5 מ”ל לתוך צינור 1.5 מ”ל. השליכו את צינורות 0.5 מ”ל עם העצמות. להשעות מחדש את כדורי מח העצם במדיה BMDM ולהעביר צינור חרוטי 15 מ”ל. הוסף מדיית BMDM עד 10 מ”ל. מניחים מסננת תאים בגודל 40 מיקרומטר על צינור חרוטי בנפח 50 מ”ל ומסננים דרכו את תרחיף מח העצם. צנטריפוגה את המתלה המסונן ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לשחזר את התאים שלמים ולהסיר פסולת קטנה מן השעיית התא. הכינו 70 מ”ל של מדיית BMDM בתוספת 50 ננוגרם/מ”ל של גורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF). השהה מחדש את הגלולה ב -10 מ”ל של מדיית BMDM בתוספת M-CSF. הוסיפו 9 מ”ל של מדיית BMDM בתוספת M-CSF לכל אחת משבע צלחות פטרי בקוטר 10 ס”מ. צלחת 1 מ”ל של תאים (סביב 1 x 107 תאים) בכל אחד משבעת צלחות פטרי 10 ס”מ. הומוגניזציה של תרחיף התא בכל צלחת על ידי זילוף בזהירות למעלה ולמטה על הצלחת ולהעביר את הלוחות לאינקובטור. לאחר 3 ימים, יש להוסיף 5 מ”ל של מדיית BMDM חמה בתוספת 50 ננוגרם/מ”ל m-csf לכל צלחת. לאחר 3 ימים (יום 6, לאחר בידוד מח עצם), יש לוודא הידבקות והתמיינות של BMDM במיקרוסקופיה.הערה: בשלב זה, ניתן להמשיך ישירות לבידוד מיטוכונדריה (שלב 3). לחילופין, ניתן להפעיל מחדש את ה-BMDM, מה שמאפשר לטפל בהם עם ציטוקינים ומולקולות קטנות. ניתוק BMDMsשאפו את המדיה מכל צלחת והוסיפו 7 מ”ל של PBS קר בתוספת 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). לדגור על התאים ב 4 ° C במשך 7-8 דקות. נתק את BMDMs על ידי זינוק זהיר למעלה ולמטה באמצעות פיפטה של 10 מ”ל. אחסן יחד את ה- BMDMs התלויים מחדש מכל שבעת הלוחות לצינור חרוטי יחיד של 50 מ”ל וצנטריפוגה במהירות של 300 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את התאים ב-40 מ”ל של מדיית BMDM חמה לספירת תאים.הערה: בין 7-9 x 107 BMDM מתקבלים לכל עכבר. מומלץ לפחות 6 x 107 BMDM לבידוד מיטוכונדריה עבור פרוטאומיקה. אם תרצה, צלחת ולטפל BMDMs בהתאם למטרת הניסוי. אם לא, המשך ישירות לשלב 3.3. 3. הכנת מקטע מיטוכונדריאלי גולמי על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית הערה: בצע את כל שלבי הצנטריפוגה ב- 4 °C. דרושות שתי צנטריפוגות האחת עם רוטור מתנדנד ומתאמים לצינורות חרוטיים בעלי כוח צנטריפוגלי יחסי של לפחות 300 x גרם, והשנייה עם כוח צנטריפוגלי יחסי של לפחות 21,000 x g המתאים לצינורות 1.5 מ”ל. בעת שימוש בתאים דבקים, השתמש במגרד תאים. עבור תאים דבקים, לשאוף את המדיה ולהוסיף 10 מ”ל של PBS לכל צלחת 15 ס”מ.הערה: גירוד תאים ב- PBS מאפשר לשטוף אותם בו זמנית. אם התאים כבר נמצאים בהשעיה, המשך ישירות לשלב 3.3. נתקו את התאים באמצעות מגרד תאים ואגרו אותם בצינור חרוטי יחיד של 50 מ”ל. הומוגניזציה של תרחיף התא על ידי pipeting למעלה ולמטה.הערה: ניתן לנתק תאים באמצעות מגרד תאים, מכיוון שזה מהיר יותר והם יעברו ליזה זמן קצר לאחר מכן. עבור כל תנאי ניסוי, להעביר 5% מנפח תרחיף התא לצינור 1.5 מ”ל ולצנוח אותו ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.הערה: בעת שימוש בתאי תרחיף, הקפד לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS לפני, כדי להסיר מזהמים אפשריים מהמדיה כגון FBS. השליכו את הסופרנאטנט והשאירו את הגלולה על קרח.הערה: זה ייצג את החלק “התא הכולל” עבור פרוטאומיקה. צנטריפוגה את שאר הדגימות משלב 3.1 או 3.2 ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. בצע את כל השלבים הבאים על קרח ובאמצעות מאגרים קרים כקרח. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא ב-5 מ”ל של חיץ מיטוכונדריה קר כקרח (MB) (210 מילימטר מניטול, 70 מ”מ סוכרוז, 10 מ”מ HEPES/NaOH [pH 7.4] ו-1 מ”מ EDTA). לשחזר את התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C. להשעות את גלולת התא ב 0.5 מ”ל של MB קר ולהעביר אותו צינור 1.5 מ”ל.הערה: הליך זה מניב ריכוז תאים משוער של 1.5 x 10 8 תאי BMDM/מ”ל או 3 x 108 תאי RAW264.7/מ”ל. באמצעות מזרק בנפח 1 מ”ל המצויד במחט של 25 גרם, ערכו הומוגניות לתרחיף התא על-ידי 30 מעברים דרך המחט (איור 1A). הוסף 1 מ”ל של MB קר לצינור וערבב על ידי היפוך. צנטריפוגה את תרחיף התא ההומוגני ב 2,000 x גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C. מעבירים 1 מ”ל של הסופרנאטנט לצינור טרי של 1.5 מ”ל על קרח מבלי להפריע לכדורית התא. השהה מחדש את גלולת התא והומוגניזציה שלה שוב, כמו בשלב 3.7. אגרו את גלולת התא ההומוגנית ואת הסופרנאטנט משני השלבים הקודמים בצינור יחיד של 1.5 מ”ל וצנטריפוגה אותו ב 2,000 x גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C.הערה: בשלב זה, הגלולה מכילה בעיקר גרעינים ותאים לא שבורים והיא מושלכת. הסופרנאטנט מכיל פסולת תאית, ציטוזול ואברונים, כולל מיטוכונדריה (איור 1B). מחלקים את הסופרנאטנט בין ארבעה צינורות של 1.5 מ”ל.הערה: חלוקת הסופרנאטנט בין צינורות מרובים בשלב זה משפרת את הסרת המזהמים בשלבים הבאים. הוסף MB כדי ליצור נפח סופי של 1 מ”ל בכל אחד מארבעת הצינורות. מערבבים על ידי היפוך וצנטריפוגה את הצינורות ב 13,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.הערה: לאחר שלב זה, גלולה עם שתי שכבות גלויה. הגלולה התחתונה, המוצקה והחומה, מכילה מיטוכונדריה ונשמרת לטיהור נוסף (איור 1C). הגלולה העליונה, הרופפת, הלבנה מכילה מבנים תאיים אחרים וניתן להשליכה. בצע שלב זה בזהירות. מוציאים את הסופרנאטנט עם כמה שיותר מהגלולה העליונה הלבנה. על ידי פיפטינג עדין על זה, ניתן להשעות מחדש את הגלולה הלבנה ולאחר מכן להשליך אותו, משאיר את הגלולה המיטוכונדריאלית החומה שלמה. שמור את אחד מארבעת הצינורות עם הגלולה המיטוכונדריאלית על קרח. זה מייצג את החלק “מיטוכונדריה גולמית” עבור פרוטאומיקה. אגרו יחד את שלושת הכדוריות האחרות בצינור של 1.5 מ”ל בנפח סופי של 1 מ”ל של MB. 4. טיהור מבוסס נוגדנים על-פאראמגנטיים של מיטוכונדריה הערה: בצע את כל השלבים הבאים בחדר קר בטמפרטורה של 4°C. העבר 1 מ”ל של התכשיר המיטוכונדריאלי הגולמי משלב 3.18 לצינור חרוטי של 15 מ”ל והוסף 7 מ”ל של MB בתוספת 150 mM NaCl (MB + NaCl).הערה: הוספת NaCl משפרת את קשירת הנוגדנים ומפחיתה קשירה לא ספציפית של המזהמים לחרוזים ולמיטוכונדריה. הוסיפו 50 מיקרוליטר של חרוזי Tomm22 לתרחיף המיטוכונדריה הגולמי בנפח 8 מ”ל (איור 1D) ודגרו על הצינור במשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C על גלגל מסתובב במהירות נמוכה.הערה: חרוזי Tomm22 קשורים באופן קוולנטי לנוגדנים חד-שבטיים Tomm22 המוגדלים בעכבר, יחד עם חרוזים על-פאראמגנטיים. בינתיים, הניחו עמוד על המגנט. אזן את העמודה עם 8 מ”ל של MB + NaCl ומחק את הזרימה. לאחר הדגירה של 15 דקות ב -4 מעלות צלזיוס של הדגימה עם חרוזי Tomm22, העבירו את הדגימה לעמודה. מחק את הזרימה.הערה: מיטוכונדריה יישארו מחוברים לחרוזים המגנטיים בעמוד (איור 1E). שטף את העמודה שלוש פעמים עם 8 מ”ל של MB + NaCl. הסר את העמוד מהמגנט ומקם אותו בצינור חרוטי של 15 מ”ל. הצהירו את המיטוכונדריה על ידי הוספת 1.5 מ”ל של MB + NaCl לעמודה, והפעילו בוכנה באופן מיידי כדי להאיר את המיטוכונדריה המטוהרים לתוך הצינור. מעבירים את המיטוכונדריה המדוללת לצינור בנפח 1.5 מ”ל וצנטריפוגות אותו בטמפרטורה של 21,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4°C.הערה: תיווצר גלולה חומה. זה מכיל את המיטוכונדריה המבודדת וחלק מהחרוזים המצומדים לנוגדנים (איור 1F). מוציאים בזהירות את הסופרנאטנט מהכדור. הגלולה מייצגת את החלק “המיטוכונדריה הטהורה” עבור פרוטאומיקה. גלולה זו יחד עם הכדוריות משלבים 3.4 ו-3.17 ניתנות לאחסון בטמפרטורה של -20°C ומוכנות ליישומים במורד הזרם.