タンパク質の発見と定量を改善するためのミトコンドリアの2段階タグフリー分離

手袋は常に着用し、細胞培養ステップは層流フードの下で実行する必要があります。細胞を5%CO2を含む37°Cのインキュベーター内で維持する。このプロトコルで提示された研究は、ローザンヌ大学とスイスの動物使用ガイドラインに準拠して承認および実施されました。 1. RAW264.7マクロファージ細胞株の培養 5%熱不活化ウシ胎児血清(HI-FBS)および100 IU / mLペニシリンおよび100 μg/mLストレプトマイシン(P / S)を添加した高グルコースおよびグルタミンを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)でマウスマクロファージRAW264.7細胞を増殖させます。注:ミトコンドリアを単離するには、単一のコンフルエントな15 cmプレート(約70 x 10 7 RAW264.7細胞)で十分です。 RAW264.7細胞を組織培養プレートで維持します。1 x 105 細胞/mLの初期播種密度は、3日でコンフルエントプレートにつながります。15 cmプレート用の培地に25 mLの細胞懸濁液を使用します。RAW264.7細胞は細胞分裂率が高く、ほとんどの細胞株よりも頻繁に分裂する必要があります。 RAW264.7 セルの切り離し培地を吸引し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を1回洗浄します。 15 cmプレートに、8 mLの温かいRAW解離バッファー(270 mM塩化カリウム、30 mMクエン酸ナトリウム二水和物H2O中、滅菌ろ過)を加え、細胞を37°Cで5分間インキュベートします。 等量の培地をプレートに加え(解離バッファーの1:1希釈)、ピペットで細胞を剥離し、ホモジナイズします。 細胞懸濁液をコニカルチューブに移し、チューブを300 x g で室温で3分間遠心分離します。 上清を吸引し、細胞カウントのためにペレットを適切な量の培地(ステップ1.1で説明)に再懸濁します。注:RAW264.7細胞を剥離するには、トリプシンやセルスクレーパーなどの他の方法を使用できます。ただし、これらの方法は細胞に対してより厳しく、剥離後の数日でM1様マクロファージへの分極につながる可能性があります。 2. 骨髄由来マクロファージ(BMDM)の単離と培養 メモ: ここで説明するプロトコルは 1 つのマウス用であり、複数のマウス用にスケールアップできます。BMDM単離および培養のための詳細なプロトコルは、他の場所に記載されている13、14。 高用量のCO2を含む8〜12週齢のC57BL / 6マウスを犠牲にします。注:オスまたはメスのマウスのいずれかを使用できます。 マウスに75%エタノールをスプレーして滅菌します。 マウス15から腰、大腿骨、および脛骨を解剖して収集します。 大腿骨および脛骨から骨髄を採取するには、両骨15の膝関節端を除去する。寛骨臼を取り除くことによって腰から骨髄を回復します。 氷上に保持した4 mLのBMDM培地(5%HI-FBS、P/S、および10 mM HEPESを添加した高グルコースおよびグルタミンを含むDMEM)を含む50 mLのコニカルチューブに骨を移します。注:解剖中の骨髄の乾燥を避けるために、骨を培地に入れておくことが重要です。 4 mLのPBSと4 mLの温かいBMDM培地を6ウェルプレートの2つの異なるウェルに加えます。 骨と培地を50 mLコニカルチューブから6ウェルプレートの空のウェルに移します。 鉗子を使用して、骨をPBSウェルに移して洗います。 温かいBMDM培地を含むウェルに骨を移します。 鉗子で2本の0.5 mLチューブの底に直径1〜2 mmの穴を開け、1.5 mLチューブに入れます。注意: この簡単な手順のために、チューブにメディアを追加する必要はありません。 各0.5 mLチューブに、露出した骨の骨髄がチューブの底を向くように大腿骨、脛骨、および股関節を置きます。 チューブを13,000 x g で室温で1分間遠心分離し、骨髄と残った培地を0.5 mLチューブの穴から1.5 mLチューブに集めます。骨の入った0.5mLチューブを廃棄します。 骨髄ペレットをBMDM培地に再懸濁し、15 mLのコニカルチューブに移します。 10 mLまでのBMDM培地を追加します。 40 μmのセルストレーナーを50 mLの円錐管に置き、骨髄懸濁液をろ過します。 ろ過した懸濁液を300 x g で室温で5分間遠心分離して、無傷の細胞を回収し、細胞懸濁液から小さな破片を取り除きます。 50 ng/mLのマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)を添加した70 mLのBMDM培地を準備します。 ペレットを10 mLのM-CSFを添加したBMDM培地に再懸濁します。 9 mLのM-CSFを添加したBMDM培地を7つの10 cmペトリ皿のそれぞれに追加します。 7つの10 cmペトリ皿のそれぞれに1 mLの細胞(約1 x 107 細胞)をプレートします。 プレート上で慎重に上下にピペッティングして各プレートの細胞懸濁液をホモジナイズし、プレートをインキュベーターに移します。 3日後、50 ng/mL M-CSFを添加した5 mLの温かいBMDM培地を各プレートに追加します。 3日後(骨髄単離後6日目)、顕微鏡検査によりBMDMの接着と鑑別を確認します。注:この時点で、ミトコンドリアの単離に直接進むことができます(ステップ3)。あるいは、BMDMを再プレートすることができ、これにより、サイトカインおよび小分子でそれらを治療することができる。 BMDM の取り外し各プレートから培地を吸引し、5 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を添加した7 mLの冷PBSを加えます。 細胞を4°Cで7〜8分間インキュベートします。 10 mLピペットを使用して慎重に上下にピペッティングして、BMDMSを取り外します。 7つのプレートすべてから再懸濁されたBMDMを単一の50 mLコニカルチューブに一緒にプールし、室温で3分間300 x g で遠心分離します。 上清を吸引し、細胞計数のために40 mLの温かいBMDM培地に細胞を再懸濁します。注:マウスごとに7〜9 x 107 BMDM が得られます。プロテオミクスには、ミトコンドリアの単離に最低6 x 107 BMDMが推奨されます。 必要に応じて、実験目標に従ってBMDMMをプレートして処理します。そうでない場合は、手順3.3に直接進んでください。 3. 示差遠心分離による粗ミトコンドリア画分の調製 注意: すべての遠心分離ステップを4°Cで実行します。 2台の遠心分離機が必要で、1台は相対遠心力が300 x g以上の円錐管用スイングアウトローターとアダプターを備え、もう1台は1.5 mLチューブに適した相対遠心力が21,000 x g以上です。接着細胞を使用する場合は、セルスクレーパーを使用してください。 接着細胞の場合は、培地を吸引し、15 cmプレートあたり10 mLのPBSを追加します。注:PBSで細胞をこすると、同時に細胞を洗浄できます。細胞がすでに懸濁液に入っている場合は、ステップ3.3に直接進んでください。 セルスクレーパーを使用して細胞を剥離し、単一の50 mLコニカルチューブにプールします。細胞懸濁液を上下にピペッティングしてホモジナイズします。注:細胞は、セルスクレーパーを使用して分離することができます、これはより速く、すぐに溶解されるためです。 各実験条件について、細胞懸濁液容量の5%を1.5 mLチューブに移し、室温で300 x g で5分間遠心分離します。注意: 浮遊細胞を使用する場合は、FBSなどの媒体から可能性のある汚染物質を除去するために、必ず前にPBSで細胞を一度洗浄してください。 上清を捨て、ペレットを氷の上に保ちます。注:これは、プロテオミクスの「全細胞」画分を表します。 ステップ3.1または3.2の残りのサンプルを300 x g で室温で5分間遠心分離します。 氷上で、氷冷バッファーを使用して、以下のすべての手順を実行します。 上清を吸引し、細胞ペレットを5 mLの氷冷ミトコンドリアバッファー(MB)(210 mMマンニトール、70 mMスクロース、10 mM HEPES/NaOH [pH 7.4]、および1 mM EDTA)に再懸濁します。 300 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離して細胞を回収します。 細胞ペレットを0.5 mLの冷たいMBに再懸濁し、1.5 mLチューブに移します。注:この手順により、1.5 x 10 8BMDM 細胞/ mLまたは3 x 108 RAW264.7細胞/ mLのおおよその細胞濃度が得られます。 25 Gの針を取り付けた1 mLのシリンジを使用して、針を30回通過させて細胞懸濁液をホモジナイズします(図1A)。 1 mLの冷たいMBをチューブに加え、反転させて混合します。ホモジナイズした細胞懸濁液を2,000 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 1 mLの上清を氷上で新しい1.5 mLチューブに移し、細胞ペレットを乱すことなく移します。細胞ペレットを再懸濁し、ステップ3.7のように再度ホモジナイズします。 ホモジナイズした細胞ペレットと前の2つのステップの上清を1本の1.5 mLチューブにプールし、2,000 x g で4°Cで5分間遠心分離します。注:この時点で、ペレットは主に核と壊れていない細胞を含み、廃棄されます。上清には、細胞破片、細胞質ゾル、およびミトコンドリアを含む細胞小器官が含まれています(図1B)。 上清を4本の1.5mLチューブに分けます。注意: この段階で上清を複数のチューブに分割すると、次の手順での汚染物質の除去が改善されます。 MBを加えて、4本のチューブのそれぞれに1 mLの最終容量を作ります。反転して混合し、チューブを13,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。注:この手順の後、2つの層を持つペレットが表示されます。底のしっかりした茶色のペレットにはミトコンドリアが含まれており、さらなる精製のために保管されています(図1C)。上部の緩い白いペレットには他の細胞構造が含まれており、廃棄することができます。 この手順は慎重に実行してください。できるだけ多くの白い上部ペレットで上清を取り除きます。その上で穏やかにピペッティングすることにより、白色ペレットを再懸濁してから廃棄し、茶色のミトコンドリアペレットをそのまま残すことができます。 ミトコンドリアペレットを入れた4本のチューブのうちの1本を氷の上に置いてください。これは、プロテオミクスの「粗ミトコンドリア」画分を表します。 他の3つのペレットを1.5 mLチューブに一緒にプールし、最終容量1 mL MBにします。 4. 超常磁性抗体を用いたミトコンドリアの精製 注意: 次のすべての手順は、4°Cの冷蔵室で実行してください。 ステップ3.18の粗ミトコンドリア製剤1 mLを15 mLのコニカルチューブに移し、150 mM NaCl(MB + NaCl)を添加した7 mLのMBを加えます。注:NaClの添加により、抗体結合が改善され、ビーズおよびミトコンドリアへの汚染物質の非特異的結合が減少します。 50 μLのTomm22ビーズを8 mLの粗ミトコンドリア懸濁液(図1D)に加え、チューブを回転ホイール上で低速で4°Cで15分間インキュベートします。注:Tomm22ビーズは、マウスで産生されたTomm22モノクローナル抗体に共有結合し、超常磁性ビーズに結合しています。 その間、磁石の上に柱を置きます。 カラムを 8 mL の MB + NaCl で平衡化し、フロースルーを廃棄します。 サンプルとTomm22ビーズを4°Cで15分間インキュベートした後、サンプルをカラムに移します。フロースルーを破棄します。注:ミトコンドリアはカラム内の磁気ビーズに付着したままになります(図1E)。 カラムを 8 mL の MB + NaCl で 3 回洗浄します。 カラムを磁石から取り外し、15 mLのコニカルチューブに入れます。 1.5 mLのMB + NaClをカラムに添加してミトコンドリアを溶出し、すぐにプランジャーを適用して精製ミトコンドリアをチューブに溶出します。 溶出したミトコンドリアを1.5 mLチューブに移し、21,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。注:茶色のペレットが形成されます。これには、単離されたミトコンドリアといくつかの抗体結合ビーズが含まれています(図1F)。 ペレットから上清を慎重に取り除きます。ペレットは、プロテオミクスの「純粋なミトコンドリア」画分を表します。このペレットは、ステップ3.4および3.17のペレットとともに、-20°Cで保存でき、下流の用途に使用できます。