オルガノイド研究のためのマウス腸陰窩および単一幹細胞からのオルガノイドの3D培養

すべてのマウス実験はサントリー動物倫理委員会(APRV000561)によって承認され、すべての動物は実験動物の管理と使用に関する委員会のガイドラインに従って維持されました。ム スムスクルスの 標準的なWT株(C57BL6 / J)を使用しました。10週齢から20週齢までの雄および雌両方のマウスを使用した。マウスをCO2 窒息で安楽死させた。 1.小腸の分離 十二指腸および空腸の近位半分を含む小腸を実験用ハサミで切除する。 組織をペトリ皿に移し、5 mLシリンジで5 mLの冷たいPBS-ABx(PBS +ペニシリン-ストレプトマイシン[1%] + ゲンタマイシン[0.5%])で小腸を洗い流して、管腔内容物を取り除きます。 ティッシュを実験用ハサミで縦に切り開き、振とうしながら冷たいPBS-ABxで手洗いします。注:スライドで絨毛をこすり落とすことにより、絨毛の汚染を減らすことができます12。 実験用ハサミを使用して、約5 mm x 5 mmの腸セグメントの断片を収集します。フラグメントをピンセット付きの50 mLチューブに移し、25 mLのコールドPBS-ABxを加えます。 25 mLの冷たいPBS-ABxで10回前後に攪拌して断片を洗浄し、50 mLチューブ内の腸内容物を除去します。 2.クリプト分離 2 mM EDTAを含むPBS-ABx中で、振とうせずに氷上で30分間インキュベートします。 細胞外マトリックス(ECM)の固化を容易にするために、事前に37°Cの組織培養インキュベーター内で24ウェルプレートをインキュベートします。 細胞培養システムからEDTA溶液を真空ポンプで吸引し、25 mLの新鮮で冷たいPBS-ABxを加え、次に手で30x-40xで激しく上下に振って陰窩-絨毛複合体を放出します。注:分離された陰窩と絨毛は、懸濁液からの25μLの液滴を4倍の倍率で顕微鏡観察することによって確認できます。 次に、懸濁液を70μmのストレーナーで1回ろ過します。 懸濁液を390 × g で4°Cで3分間遠心分離します。 クリプトペレットを20 mLのソルビトールDMEM(アドバンストDMEM/F12 + ペニシリン-ストレプトマイシン[1%] + ゲンタマイシン[0.5%] + ウシ胎児血清[1%] + ソルビトール[2%])にピペッティングで再懸濁し、クリプト懸濁液を2つの新しい15 mLチューブに移し、2つの10 mL溶液に分割して低速で遠心分離します。注:大きな細胞塊と細胞/破片は、低速遠心分離を使用して分離できます。大きな細胞塊はペレットにあり、細胞/破片は上清にあります。 2つの陰窩懸濁液を80 × g で4°Cで3分間遠心分離し、上清を穏やかに吸引します。注意: ペレットの形成が弱いので、あまり誤嚥しないでください。各チューブに2mLの上清を残します。 10 mLのソルビトールDMEMを各チューブに再度加えます。懸濁液を80 × g で4°Cで3分間遠心分離します。 上清を吸引した後、各チューブに2 mLの上清を残し、再懸濁のために10 mLのソルビトールDMEMを加え、クリプト懸濁液を80 × g で遠心分離し、最後の3分間を4°Cで行います。 上清を吸引した後、各チューブに2 mLの上清を残し、10 mLの完全DMEM(アドバンストDMEM/F12 + ペニシリン-ストレプトマイシン[1%] + ゲンタマイシン[0.5%] + ウシ胎児血清[1%])を加えて、上下にピペッティングしてペレットを再懸濁し、1分間放置します。注:フローティングクリプトを効率的に取得するには、1分間待ちます。 1分後、各10 mL懸濁液を合計20 mLに集め、70 μmのセルストレーナーで1回ろ過して陰窩を精製します。 基本的に純粋な陰窩を播種する前に、ろ過された完全なDMEM内の陰窩の数を数え、290 × g で4°Cで3分間遠心分離します。25 μLの液滴を6 cmの皿に3点ずつ滴下します。顕微鏡下で4倍の倍率で陰窩の数を数え、25μLの液滴あたりの陰窩の濃度を計算します。 1ウェルあたり40 μLのECMで100個の陰窩を吊り下げます。ピペットを上下に5x-10xして、ECM内の陰窩の均質な懸濁液を得てから、37°Cに予熱した24ウェルプレートに播種します。注意: 重合を避けるために、ECMは常に氷上に置いてください。ECMで気泡が発生しないように慎重にピペットで行います。 ECMの重合のために、24ウェルプレートを37°C、5%CO2 インキュベーター内で15分間インキュベートします。 最後に、ECMをマウス上皮成長因子(EGF)、組換えマウスR-スポンジン1、および組換えマウスNogginを含む500 μLの培養液で室温で覆います。ウェルあたりの材料の最終濃度は次のとおりです:ペニシリン-ストレプトマイシン(1%)、それぞれ50 U / mL;ゲンタマイシン (0.5%), 25 μg/mL;EGF, 20 ng/mL;ノギン、100 ng / mL;R-スポンジン 1, 500 ng/mL;L-グルタミン、2 mM。 5%CO2 インキュベーター内で37°Cでクリプト培養を開始します。注:24ウェルプレート内のオルガノイドの培地については、 表1を参照してください。 3時間ごとに20倍の対物レンズを備えた記録タイムラプス画像顕微鏡で、オルガノイドの形態形成を最大7日間観察する長期ライブイメージングを実施します。1 μmのzステップ(1 μm x 5ステップ)で連続Zスタック画像を取得します。 一日おきに培地を交換してください。 3. 蛍光活性化セルソーティング(FACS) マウスから陰窩を分離します(セクション2を参照)。 単離した陰窩を2 mLのトリプシンで37°Cで30分間処理します。 10 mLのPBSで反応を停止し、20 μmのセルストレーナーを通過させます。 溶液を390 × g で4°Cで3分間遠心分離し、100 μLの完全DMEMで再懸濁します。 抗EphB2 APC結合抗体(1/50)を添加し、氷上で30分間インキュベートします。 細胞をPBSで3倍洗浄し、最後に7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)(1/100)を加えます。 染色された細胞をFACS で ソートします。面積スケーリング係数を調整し、セル サイズ (前方散乱、FSC-A) と粒度 (側方散乱、SSC-A) に従って並べ替えます。 7-AAD陰性細胞と陽性細胞を、波長488 nmおよび50 mVパワーに設定したレーザーで生存率について分類します。 波長640 nm、出力100 mVに設定されたレーザーを使用して、EphB2高(EphB2高)、EphB2中(EphB2med)、EphB2低(EphB2低)、およびEphB2陰性(EphB2陰性)の細胞を分類するためにゲートを画定します。 5%CO2インキュベーター内で37°CでEphB2高細胞培養を開始する。 4. シングルセル培養オルガノイド 段階的なEphB2表面レベル11に従って細胞分離法を実行し、4つの異なる集団(高、中、低、および陰性)を取得します。 回収し、390 × g で4°Cで3分間遠心分離してペレット化し、ピペッティングによって単一選別されたEphB2ハイ セルをECMに埋め込み、続いて24ウェルプレート(100シングレット/ 40 μLのECM /ウェル)に播種します。 ステップ2.14と同様に、ECMを重合させ、最初の2日間はRho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤(10 μM)を含む培養液でECMを覆い、EphB2高 細胞を維持します。注:ROCK阻害剤はアノイキスに対して有効です。 倒立顕微鏡を使用して40倍の倍率で細胞を手動で検査し、スフェロイド形成と陰窩突起のある生存可能なオルガノイドを観察します。