De 3D-kweek van organoïden uit murine darmcrypten en een enkele stamcel voor organoïde onderzoek

Alle muizenexperimenten werden goedgekeurd door de Suntory Animal Ethics Committee (APRV000561) en alle dieren werden onderhouden in overeenstemming met de richtlijnen van de commissie voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Er werd een standaard WT-stam van Mus musculus (C57BL6/J) gebruikt. Zowel mannelijke als vrouwelijke muizen van 10 weken tot 20 weken oud werden gebruikt. De muizen werden geëuthanaseerd met CO 2-verstikking. 1. Isolatie van de dunne darm Snijd de dunne darm, inclusief de twaalfvingerige darm en de proximale helft van het jejunum, met een laboratoriumschaar. Breng het weefsel over in een petrischaaltje en spoel de dunne darm met 5 ml koude PBS-ABx (PBS + penicilline-streptomycine [1%] + gentamicine [0,5%]) in een spuit van 5 ml om de luminale inhoud te verwijderen. Knip het weefsel in de lengte open met een laboratoriumschaar en was het handmatig met koude PBS-ABx tijdens het schudden.OPMERKING: Door de villi met een glaasje uit te schrapen, kan villusbesmetting worden verminderd12. Verzamel ongeveer 5 mm x 5 mm stukjes van het darmsegment met behulp van een laboratoriumschaar. Breng de fragmenten over in een buis van 50 ml met een pincet en voeg 25 ml koude PBS-ABx toe. Was de fragmenten door 10x heen en weer te roeren met 25 ml koude PBS-ABx om de darminhoud in de buis van 50 ml te verwijderen. 2. Crypt isolatie Incubeer de stukken in PBS-ABx met 2 mM EDTA gedurende 30 minuten op ijs zonder schudden. Voor eenvoudige stolling van de extracellulaire matrix (ECM), incubeer vooraf een 24-well plaat in een 37 °C weefselkweekincubator. Zuig de EDTA-oplossing uit het celkweeksysteem op met een vacuümpomp, voeg 25 ml verse, koude PBS-ABx toe en schud de stukken vervolgens krachtig op en neer met de hand 30x-40x om de crypt-villuscomplexen vrij te geven.OPMERKING: De gescheiden crypten en villi kunnen worden gecontroleerd door de microscopische waarneming van een druppel van 25 μL uit de suspensie bij 4x vergroting. Filter vervolgens de suspensie eenmaal door een zeef van 70 μm. Centrifugeer de suspensie gedurende 3 minuten bij 390 × g bij 4 °C. Resuspendeer de cryptpellet in 20 ml sorbitol DMEM (geavanceerde DMEM / F12 + penicilline-streptomycine [1%] + gentamicine [0,5%] + foetaal runderserum [1%] + sorbitol [2%]) met pipetteren en breng de cryptuspensie over naar twee nieuwe buizen van 15 ml voor verdeling in twee oplossingen van 10 ml om met lage snelheid te centrifugeren.OPMERKING: De grote celmassa en cellen/puin kunnen worden gescheiden met behulp van centrifugatie met lage snelheid. De grote celmassa zit in de pellet en cellen/puin zitten in het supernatant. Centrifugeer de twee crypte suspensies bij 80 × g gedurende 3 minuten bij 4 °C en zuig het supernatant vervolgens voorzichtig op.OPMERKING: Aangezien de pelletvorming zwak is, moet u niet te veel opzuigen. Laat 2 ml supernatant in elke buis. Voeg 10 ml sorbitol DMEM opnieuw toe aan elke buis. Centrifugeer de suspensie gedurende 3 minuten bij 4 °C bij 80 × g . Voeg na het opzuigen van het supernatant, waarbij 2 ml supernatant in elke buis achterblijft, 10 ml sorbitol DMEM voor resuspensie en centrifugeer de cryptuspensie bij 80 × g gedurende een laatste 3 minuten bij 4 °C. Voeg na het aanzuigen van het supernatant, waarbij 2 ml supernatant in elke buis achterblijft, 10 ml volledige DMEM (geavanceerde DMEM / F12 + penicilline-streptomycine [1%] + gentamicine [0,5%] + foetaal runderserum [1%]) voor resuspensie van de pellet door op en neer te pipetteren en laat het 1 min.OPMERKING: Wacht 1 minuut om de drijvende crypten efficiënt te verkrijgen. Verzamel na 1 minuut elke suspensie van 10 ml voor een totaal van 20 ml en filter eenmaal met een celzeef van 70 μm om de crypten te zuiveren. Voordat u in wezen zuivere crypten zaait, telt u het aantal crypten in de gefilterde volledige DMEM en centrifugeert u vervolgens gedurende 3 minuten bij 4 °C bij 290 × g .Druppel 25 μL druppels in een schaal van 6 cm op drie punten. Tel het aantal crypten onder een microscoop bij 4x vergroting en bereken de concentratie van crypten per druppel van 25 μL. Suspenseer 100 crypten met 40 μL ECM per put. Pipetteer 5x-10x op en neer om een homogene suspensie van crypten in de ECU te verkrijgen, en zaai vervolgens in een voorverwarmde 24-putplaat van 37 °C.OPMERKING: Houd de ECU altijd op ijs om polymerisatie te voorkomen. Pipetteer voorzichtig om te voorkomen dat er luchtbellen in de ECU ontstaan. Incubeer de 24-well plaat gedurende 15 minuten in een 37 °C, 5% CO2 incubator voor de polymerisatie van de ECM. Bedek ten slotte de ECM met 500 μL kweekmedium dat de epidermale groeifactor (EGF) van de muis, recombinant R-spondin 1 en de recombinante muis Noggin bij kamertemperatuur bevat. De uiteindelijke concentratie van materialen per put is als volgt: penicilline-streptomycine (1%), 50 U / ml elk; gentamicine (0,5%), 25 μg/ml; EFG, 20 ng/ml; Noggin, 100 ng / ml; R-spondin 1, 500 ng / ml; L-glutamine, 2 mM. Start de crypte cultuur bij 37 °C in een 5% CO2 incubator.OPMERKING: Voor het kweekmedium voor organoïden in een plaat met 24 putten, zie tabel 1. Voer langdurige live beeldvorming uit om organoïde morfogenese te observeren met een opname-time-lapse-beeldmicroscoop uitgerust met een 20x-objectief om de 3 uur gedurende maximaal 7 dagen. Verkrijg seriële z-gestapelde beelden bij z-stappen van 1 μm (1 μm x vijf stappen). Verander het medium om de dag. 3. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) Isoleer crypten van de muizen (zie rubriek 2). Behandel de geïsoleerde crypten met 2 ml trypsine gedurende 30 minuten bij 37 °C. Stop de reactie met 10 ml PBS en ga vervolgens door een celzeef van 20 μm. Centrifugeer de oplossing gedurende 3 minuten bij 4 °C bij 390 × g en resuspensie met 100 μl volledige DMEM. Voeg anti-EphB2 APC-geconjugeerd antilichaam (1/50) toe en incubeer gedurende 30 minuten op ijs. Was de cellen 3x met PBS en voeg ten slotte 7-amino-actinomycine D (7-AAD) (1/100) toe. Sorteer de gekleurde cellen via FACS.Pas de gebiedsschaalfactor aan en sorteer op celgrootte (voorwaartse verstrooiing, FSC-A) versus granulariteit (zijverstrooiing, SSC-A). Sorteer 7-AAD negatieve en positieve cellen op levensvatbaarheid met de laser ingesteld op een golflengte van 488 nm en 50 mV vermogen. Baken de poorten af om de EphB2-high (EphB2high), EphB2-medium (EphB2med), EphB2-low (EphB2low) en EphB2-negative (EphB2neg) cellen te sorteren met de laser ingesteld op een golflengte van 640 nm en 100 mV vermogen. Start de EphB2high cell culture bij 37 °C in een 5% CO2 incubator. 4. Eencellige gekweekte organoïden Voer de celisolatiemethode uit volgens gegradeerde EphB2-oppervlakteniveaus11 en verkrijg vervolgens vier verschillende populaties (hoog, gemiddeld, laag en negatief). Verzamel, pellet met centrifugatie bij 390 × g gedurende 3 minuten bij 4 °C en sluit de enkelgesorteerde EphB2-hoge cellen in de ECU in door pipetteren, gevolgd door zaaien op een plaat met 24 putten (100 singlets / 40 μL ECU / put). Laat de ECM net als in stap 2.14 polymeriseren en bedek de ECM met een kweekmedium dat een Rho-geassocieerde kinase (ROCK)-remmer (10 μM) bevat gedurende de eerste 2 dagen om de EphB2hoge cellen te behouden.OPMERKING: De ROCK-remmer is effectief tegen anoikis. Inspecteer de cellen handmatig met behulp van een omgekeerde microscoop bij 40x vergroting en observeer levensvatbare organoïden met sferoïdevorming en crypte-uitsteeksel.