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Biology

Die 3D-Kultivierung von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einer einzelnen Stammzelle für die Organoidforschung

Published: April 07, 2023
doi:
10.3791/65219
, ,
1Suntory Foundation for Life Sciences,Bioorganic Research Institute, 2Institute for Integrated Cell-Material Sciences (KUIAS-iCeMS),Kyoto University, 3Faculty of Medicine,Osaka Medical and Pharmaceutical University

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung von murinen Dünndarmkrypten und kultivieren intestinale 3D-Organoide aus den Krypten. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode zur Generierung von Organoiden aus einer einzelnen intestinalen Stammzelle in Abwesenheit einer subepithelialen zellulären Nische.

Abstract

Gegenwärtig stellt die Organoidkultur ein wichtiges Werkzeug für In-vitro-Studien verschiedener biologischer Aspekte und Erkrankungen in verschiedenen Organen dar. Mause Dünndarmkrypten können Organoide bilden, die das Darmepithel nachahmen, wenn sie in einer extrazellulären 3D-Matrix kultiviert werden. Die Organoide setzen sich aus allen Zelltypen zusammen, die verschiedene homöostatische Funktionen im Darm erfüllen. Dazu gehören Paneth-Zellen, enteroendokrine Zellen, Enterozyten, Becherzellen und Büschelzellen. Gut charakterisierte Moleküle werden dem Nährmedium zugesetzt, um die intestinalen Stammzellen (ISCs) anzureichern, die mit Leucin-reichen Wiederholungen markiert sind, die den G-Protein-gekoppelten Rezeptor 5 enthalten, und werden verwendet, um die Differenzierung entlang spezifischer Linien voranzutreiben. Zu diesen Molekülen gehören der epidermale Wachstumsfaktor, Noggin (ein knochenmorphogenetisches Protein) und R-Spondin 1. Darüber hinaus wird ein Protokoll zur Generierung von Organoiden aus einem einzelnen Erythropoietin-produzierenden hepatozellulären Rezeptor B2 (EphB2)-positiven ISC detailliert beschrieben. In diesem Methodenartikel werden Techniken beschrieben, um Dünndarmkrypten und einen einzelnen ISC aus Geweben zu isolieren und die effiziente Etablierung von Organoiden zu gewährleisten.

Introduction

Darmorganoide, die erstmals 2009 etabliert wurden, haben sich aufgrund ihrer morphologischen und funktionellen Ähnlichkeit mit reifen Geweben zu einem leistungsstarken In-vitro-Werkzeug für die Untersuchung der Darmbiologie entwickelt. In jüngster Zeit haben technologische Fortschritte bei kultivierten Organoiden, die aus Stammzellen aus adultem Gewebe gewonnen werden, die langfristige Kultivierung von intestinalen Stammzellen (ISCs) mit Selbsterneuerungs- und Differenzierungspotenzial ermöglicht. Diese Organoide wurden häufig für Grundlagen- und translationale Forschungsstudien zur gastrointestinalen Physiologie und Pathophysiologie verwendet 1,2,3,4,5,6. Die von der Clevers-Gruppe entwickelten 3D-Organoide bieten ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung des Darmepithels mit verbesserter physiologischer Relevanz7. Da Darmorganoide aus Gewebestammzellen gewonnen werden und aus mehreren Zelltypen zusammengesetzt sind, rekapitulieren sie die Funktionalität des Darmepithels. Bemerkenswert ist, dass eine einfach sortierte Leucin-reiche Repeats-enthaltende G-Protein-gekoppelte Rezeptor-5-positive (Lgr5+) Stammzelle auch 3D-Organoide ohne Paneth-Zellen oder eine ISC-Nische wie die Epithelnische oder Stromanische7 erzeugen kann. Allerdings ist die organoidbildende Kapazität von einfach sortierten Lgr5+-Zellen im Vergleich zu denen von Krypten- und ISC-Paneth-Zelldublettengering 8.

Immer mehr Studien haben gezeigt, dass die Methoden der Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Inkubation oder Kollagenase-Dissoziation zu einer Lockerung des Epithels und zur Freisetzung von Krypten führen. Da die enzymatische Dissoziation einen Einfluss auf den Zellzustand von Krypten haben kann, wird in der Regel eine mechanische Isolationsmethode verwendet, um das Gewebe zu dissoziieren. Obwohl es sich bei der mechanischen Verdauung um eine schnelle Technik handelt, kann diese Methode mit inkonsistenten Kryptenausbeuten oder einer schlechten Lebensfähigkeit der Zellen in Verbindung gebracht werden9. Daher können EDTA-Behandlung und mechanische Dissoziation kombiniert werden, um bessere Krypto-Ausbeuten zu erzielen. Ein Merkmal der in diesem Artikel gezeigten Methodik ist die Verwendung von kräftigem Schütteln der Gewebefragmente nach EDTA-Chelatbildung10. Kräftiges Schütteln ermöglicht die effiziente Isolierung von Krypten aus Krypten-Zotten-Komplexen im Dünndarm. Der Grad des manuellen Schüttelns bestimmt die Trennung. Daher ist die Gewinnung von Krypten aus Komplexen für Experimentatoren auf diesem Gebiet wichtig. Darüber hinaus kann die richtige Geschicklichkeit die Kontamination der Zotten auf ein Minimum reduzieren und die Anzahl der Krypten erhöhen.

Daher kann dieses experimentelle Protokoll, bei dem aus Mäusen gewonnene Dünndarmorganoide verwendet werden, Krypten nach der Behandlung mit EDTA zur Dissoziation besser mit physikalischer Kraft isolieren. Es ist bekannt, dass das Expressionsmuster des Erythropoietin-produzierenden hepatozellulären Rezeptors B2 (EphB2) zum Teil die Kryptenumgebung widerspiegelt. Zum Beispiel sind EphB2-positive Zellen von unten nach oben11 organisiert. Basierend auf der EphB2-Expression wurde eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) durchgeführt, und die erhaltenen Zellen wurden in vier Gruppen eingeteilt: EphB2hoch, EphB2med, EphB2niedrig und EphB2neg. Anschließend wurde das Organoidwachstum von einfach sortierten EphB2-Zellen in Wildtyp-Mäusen (WT) demonstriert.

Protocol

Alle Mausversuche wurden von der Suntory Animal Ethics Committee (APRV000561) genehmigt, und alle Tiere wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Komitees für die Pflege und Verwendung von Labortieren gehalten. Es wurde ein Standard-WT-Stamm des Mus musculus (C57BL6/J) verwendet. Es wurden sowohl männliche als auch weibliche Mäuse im Alter von 10 Wochen bis 20 Wochen verwendet. Die Mäuse wurden mit CO2 -Erstickung eingeschläfert. 1. Isolierung des Dünndarms Den Dünndarm, einschließlich des Zwölffingerdarms und der proximalen Hälfte des Jejunums, wird mit einer Laborschere entfernt. Übertragen Sie das Gewebe in eine Petrischale und spülen Sie den Dünndarm mit 5 ml kaltem PBS-ABx (PBS + Penicillin-Streptomycin [1%] + Gentamicin [0,5%]) in einer 5-ml-Spritze, um den luminalen Inhalt zu klären. Schneiden Sie das Gewebe der Länge nach mit einer Laborschere auf und waschen Sie es unter Schütteln manuell mit kaltem PBS-ABx.Anmerkungen: Durch das Auskratzen der Zotten mit einem Objektträger kann die Zottenkontamination reduziert werden12. Sammeln Sie ca. 5 mm x 5 mm große Stücke des Darmsegments mit einer Laborschere. Übertragen Sie die Fragmente mit einer Pinzette in ein 50-ml-Röhrchen und fügen Sie 25 ml kaltes PBS-ABx hinzu. Waschen Sie die Fragmente, indem Sie 10x mit 25 ml kaltem PBS-ABx hin und her rühren, um den Darminhalt im 50-ml-Röhrchen zu entfernen. 2. Krypta-Isolation Inkubieren Sie die Stücke in PBS-ABx mit 2 mM EDTA für 30 min auf Eis ohne Schütteln. Zur einfachen Verfestigung der extrazellulären Matrix (EZM) wird zuvor eine 24-Well-Platte in einem 37 °C heißen Gewebekultur-Inkubator inkubiert. Saugen Sie die EDTA-Lösung mit einer Vakuumpumpe aus dem Zellkultursystem ab, fügen Sie 25 ml frisches, kaltes PBS-ABx hinzu und schütteln Sie die Stücke dann 30x-40x kräftig von Hand auf und ab, um die Krypten-Zotten-Komplexe freizusetzen.HINWEIS: Die separierten Krypten und Zotten können durch die mikroskopische Betrachtung eines 25 μL Tröpfchens aus der Suspension bei 4-facher Vergrößerung überprüft werden. Anschließend wird die Suspension einmal durch ein 70 μm Sieb gefiltert. Die Suspension wird bei 390 × g für 3 min bei 4 °C zentrifugiert. Resuspendieren Sie das Kryptenpellet in 20 ml Sorbit DMEM (fortgeschrittenes DMEM/F12 + Penicillin-Streptomycin [1 %] + Gentamicin [0,5 %] + fetales Kälberserum [1 %] + Sorbit [2 %]) durch Pipettieren und übertragen Sie die Kryptensuspension in zwei neue 15-ml-Röhrchen zur Aufteilung in zwei 10-ml-Lösungen, um sie bei niedriger Geschwindigkeit zu zentrifugieren.Anmerkungen: Die große Zellmasse und die Zellen/Trümmer können durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit getrennt werden. Die große Zellmasse befindet sich im Pellet und die Zellen/Trümmer befinden sich im Überstand. Die beiden Kryptensuspensionen werden bei 80 × g für 3 min bei 4 °C zentrifugiert und anschließend der Überstand vorsichtig abgesaugt.Anmerkungen: Da die Pelletbildung schwach ist, saugen Sie nicht zu viel ab. Lassen Sie 2 ml Überstand in jedem Röhrchen. Geben Sie wieder 10 ml Sorbit DMEM in jedes Röhrchen. Die Suspension wird bei 80 × g für 3 min bei 4 °C zentrifugiert. Nach dem Absaugen des Überstandes, wobei 2 ml Überstand in jedem Röhrchen verbleiben, werden 10 ml Sorbit DMEM zur Resuspension hinzugefügt und die Kryptensuspension bei 80 × g für die letzten 3 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Nach dem Absaugen des Überstandes, wobei 2 ml Überstand in jedem Röhrchen verbleiben, fügen Sie 10 ml vollständiges DMEM (fortgeschrittenes DMEM/F12 + Penicillin-Streptomycin [1%] + Gentamicin [0,5%] + fetales Kälberserum [1%]) zur Resuspension des Pellets durch Auf- und Abpipettieren hinzu und lassen Sie es 1 Minute einwirken.HINWEIS: Wartet 1 Min., um die schwebenden Krypten effizient zu erhalten. Sammeln Sie nach 1 Minute jede 10-ml-Suspension für insgesamt 20 ml und filtrieren Sie einmal mit einem 70-μm-Zellsieb, um die Krypten zu reinigen. Bevor Sie im Wesentlichen reine Krypten aussäen, zählen Sie die Anzahl der Krypten im gefilterten vollständigen DMEM und zentrifugieren Sie dann bei 290 × g für 3 min bei 4 °C.25 μL Tröpfchen an drei Stellen in eine 6 cm große Schüssel träufeln. Zählen Sie die Anzahl der Krypten unter einem Mikroskop bei 4-facher Vergrößerung und berechnen Sie die Konzentration der Krypten pro 25-μl-Tröpfchen. Suspendieren Sie 100 Krypten mit 40 μl ECM pro Well. Pipettieren Sie 5x-10x auf und ab, um eine homogene Suspension der Krypten im ECM zu erhalten, und säen Sie dann in einer bei 37 °C vorgewärmten 24-Well-Platte.Anmerkungen: Halten Sie das ECM immer auf Eis, um eine Polymerisation zu vermeiden. Pipettieren Sie vorsichtig, um Luftblasen im Motorsteuergerät (ECM) zu vermeiden. Die 24-Well-Platte wird für 15 min in einem 37 °C, 5% CO2 -Inkubator für die Polymerisation des ECM inkubiert. Zum Schluss wird die EZM mit 500 μl Nährmedium bedeckt, das den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) der Maus, das rekombinantes R-Spondin 1 der Maus und das rekombinante Noggin der Maus bei Raumtemperatur enthält. Die Endkonzentration der Materialien pro Vertiefung ist wie folgt: Penicillin-Streptomycin (1%), jeweils 50 U/ml; Gentamicin (0,5%), 25 μg/ml; EGF, 20 ng/ml; Noggin, 100 ng/ml; R-Spondin 1 ,500 ng/ml; L-Glutamin, 2 mM. Beginnen Sie die Kryptenkultur bei 37 °C in einem 5% CO2 -Inkubator.Anmerkungen: Für das Nährmedium für Organoide in einer 24-Well-Platte siehe Tabelle 1. Führen Sie bis zu 7 Tage lang alle 3 Stunden eine Langzeit-Live-Bildgebung durch, um die Organoid-Morphogenese mit einem Aufnahme-Zeitraffer-Bildmikroskop zu beobachten, das mit einem 20-fach-Objektiv ausgestattet ist. Erhalten Sie serielle z-gestapelte Bilder in Z-Schritten von 1 μm (1 μm x fünf Schritte). Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag. 3. Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) Isolieren Sie Krypten von den Mäusen (siehe Abschnitt 2). Behandeln Sie die isolierten Krypten mit 2 ml Trypsin für 30 min bei 37 °C. Stoppen Sie die Reaktion mit 10 ml PBS und passieren Sie dann ein 20-μm-Zellsieb. Die Lösung wird bei 390 × g für 3 min bei 4 °C zentrifugiert und mit 100 μl vollständigem DMEM resuspendiert. Anti-EphB2 APC-konjugierter Antikörper (1/50) zugeben und 30 Minuten auf Eis inkubieren. Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS und fügen Sie schließlich 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) hinzu (1/100). Sortieren Sie die gefärbten Zellen über FACS.Passen Sie den Skalierungsfaktor für die Fläche an, und sortieren Sie nach Zellengröße (Vorwärtsstreuung, FSC-A) und Granularität (Seitenstreuung, SSC-A). Sortieren Sie 7-AAD-negative und -positive Zellen auf ihre Lebensfähigkeit, wobei der Laser auf eine Wellenlänge von 488 nm und eine Leistung von 50 mV eingestellt ist. Markieren Sie die Gates, um die EphB2-hohen (EphB2hoch), EphB2-mittleren (EphB2med), EphB2-niedrigen (EphB2niedrig) und EphB2-negativen (EphB2neg) Zellen zu sortieren, wobei der Laser auf eine Wellenlänge von 640 nm und eine Leistung von 100 mV eingestellt ist. Beginnen Sie die EphB2-Hochzellkultur bei 37 °C in einem 5% CO2 -Inkubator. 4. Einzelzellkultivierte Organoide Führen Sie die Zellisolationsmethode gemäß den abgestuften EphB2-Oberflächenniveaus11 durch und erhalten Sie dann vier verschiedene Populationen (hoch, mittel, niedrig und negativ). Sammeln, pelletieren Sie mit Zentrifugation bei 390 × g für 3 min bei 4 °C und betten Sie die einfach sortierten EphB2-High-Zellen durch Pipettieren in das ECM ein, gefolgt von der Aussaat auf einer 24-Well-Platte (100 Singuletts/40 μl ECM/Well). Lassen Sie die EZM wie in Schritt 2.14 polymerisieren und bedecken Sie die EZM in den ersten 2 Tagen mit einem Nährmedium, das einen Rho-assoziierten Kinase-Inhibitor (ROCK) (10 μM) enthält, umdie EphB2-Zellen zu erhalten.HINWEIS: Der ROCK-Inhibitor ist wirksam gegen Anoikis. Untersuchen Sie die Zellen manuell mit einem inversen Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung und beobachten Sie lebensfähige Organoide mit Sphäroidbildung und Kryptenvorsprung.

Representative Results

Um Dünndarm-Organoide von Mäusen zu erzeugen, kann eine Kombination aus EDTA-Behandlung und einer mechanischen Isolationsmethode verwendet werden, um Krypten effizient zu isolieren10,13. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass fast alle isolierten Krypten sofort versiegelt wurden und kegelförmig erschienen, nachdem sie aus den Epithelnischen gequetscht wurden (Abbildung 1A). Um die Kontamination der Zotten zu minimieren, wurde die resultierende Suspension durch ein 70-μm-Zellsieb geleitet und anschließend das Filtrat zentrifugiert. Da einige Krypten während der Filtration und Suspension gestört werden, sollten diese Schritte sorgfältig durchgeführt werden. Die Ergebnisse zeigten, dass fast alle Krypten in der Endfraktion integriert und für den Einsatz in der Kultur geeignet waren (Abbildung 1B). Um alle plattierten Krypten einzeln zu visualisieren, wurden 100 Krypten pro Well plattiert (Abbildung 1C). Nach Zugabe des spezifischen Kryptenkulturmediums (Abbildung 1D) wurde die Entwicklung der Organoide täglich mit einem Mikroskop überwacht. Darüber hinaus wurde das Organoidwachstum aus den Krypten durch Zeitrafferaufnahmen beobachtet, um ihre Entwicklung zu überwachen (Abbildung 1E und ergänzendes Video S1). Die kultivierten Krypten verhielten sich stereotyp. Das innere Lumen des Organoids war mit einer Masse apoptotischer Zellen gefüllt. Die aktive Proliferation und Differenzierung von ISCs erfolgte in der Kryptenregion mit Knospung (Abbildung 1E und ergänzendes Video S1). Die Knospung war mit ISC-Migration und -Proliferation sowie der Differenzierung von Paneth-Zellen gekoppelt. Die differenzierten Paneth-Zellen befanden sich immer an der Knospungsstelle (ergänzende Abbildung S1). Da die Organoide in Kultur mit einem inversen Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung als stabil bestätigt wurden, konnte die Technik verwendet werden, um die Kryptenbildung im sich entwickelnden Dünndarm zu untersuchen und die Fähigkeit zur Geweberegeneration und das ISC-Langzeitüberleben für die Produktion neuer Darmepithelzellen zu bestimmen14,15,16. Lgr5 ist als ISC-Marker definiert, und murine Lgr5+-Zellen bilden 3D-Organoide7. Da die Zelloberflächenhäufigkeit des LGR5-Proteins jedoch gering ist und es an hochaffinen Anti-LGR5-Antikörpern mangelt, ist es schwierig, murine ISCs effizient durch FACS zu isolieren. EphB2 wurde bereits als Oberflächenmarker für die Aufreinigung von murinen und humanen ISCs aus Darmgewebe identifiziert17,18. Das Expressionsmuster von EphB2 erhöht die Komplexität von ISC-Markern. EphB2-positive Zellen sind im gesamten proliferativen Kompartiment organisiert und erreichen ihren Höhepunkt am unteren Ende der Krypten, während sie in einem Gradienten nach oben hin abnehmen11. Paneth-Zellen und Vorläuferzellen sind ebenfalls in der Krypta lokalisiert. Paneth-Zellen exprimieren hauptsächlich EphB3, das für ihre Positionierung benötigt wird, und die Vorläuferzellen über ihnen in der Krypta exprimieren hauptsächlich EphB2. So kann es im Zuge der ISC-Aufreinigung mit dem Anti-EphB2-Antikörper zu einer Kontamination beider Zelltypen kommen. Dementsprechend sollten ihre Markergenexpression und die organoidbildende Kapazität von Zellen, die mit Hilfe von EphB2 mittels FACS isoliert wurden, bewertet werden. Basierend auf diesen Fakten können mit Hilfe der FACS-Analyse EphB2-oberflächenmarkierte Zellen aus WT-Krypten19 isoliert werden. Es wurde untersucht, ob die EphB2-Expression zwischen vier Gruppen mit der Expression spezifischer Marker unterscheiden kann, wie z.B. ISC-spezifische Markergene (Lgr5, Ascl2 und Olfm4) und Vorläuferzell-spezifische Markergene (Ki67, Myc und FoxM1). Dieses Experiment zeigte,dass EphB2-Zellen überwiegend ISCs waren, im Gegensatz zu EphB2-med-Zellen20,21. Schließlich wurden die erhaltenen Zellen auf der Grundlage der Zellisolationsmethode in vier Gruppen eingeteilt (EphB2hoch, EphB2med, EphB2niedrig und EphB2neg Zellen) (Abbildung 2). Anschließend wurden einzelne Zellen, die hohe Konzentrationen von EphB2 exprimierten, sortiert durch FACS, für das Organoidwachstum kultiviert. Eine einzelne EphB2-hohe Zelle kann unabhängig voneinander zur lokalisierten Behandlung eingesetzt werden und selbstorganisierende kryptisch-villöse Strukturen nachbilden, die an den normalen Dünndarm erinnern (Abbildung 3). Die Zellen, die von anderen Gruppen abgeleitet sind (EphB2med, EphB2low und EphB2neg), erzeugen jedoch keine Organoide20. In einer früheren Studie waren ~6% der einfach sortierten Lgr5-GFP-hi-Zellen in der Lage, kryptisch-villöse Organoide zu initiieren7. Die verbliebenen Zellen waren jedoch nicht in der Lage, Organoide zu bilden und starben innerhalb der ersten 12 h7. Die Autoren vermuteten, dass dies das Ergebnis von physikalischem und/oder biologischem Stress war, der dem Isolationsverfahren innewohnte7. Weniger als 6% Organoidwachstum wurde auch aus einfach sortierten EphB2-High-Zellen in WT-Mäusen erzielt. Am 5. Tag der Kultur bildeten sich kugelförmige Strukturen (Abbildung 3). Von Tag 7 bis Tag 9 kam es zu einer Evagination der Flecken, um Krypten zu bilden (Abbildung 3). Wichtig ist, dass die Applikation eines ausgewählten ROCK-Inhibitors aufdie einzelsortierten EphB2-Zellen die dissoziationsinduzierte Apoptose verringerte und die Effizienz des Organoidwachstums erhöhte. Abbildung 1: Generierung von Dünndarm-Organoiden der Maus. (A) Krypten, die durch eine Kombination von EDTA-Chelatbildung und mechanischer Dissoziation hergestellt wurden. (B) Resultierende gereinigte Krypten. (C) Krypten, die in die extrazelluläre Matrix eingebettet sind. (A-C) Die schwarzen Pfeile deuten auf Krypten hin. (D) Dreidimensionale Kultur von Krypten und Organoiden. (E) Repräsentative Bilder eines wachsenden Organoids, das aus einer Krypta stammt. Die weißen Pfeile deuten auf den Austrieb der Krypta hin. Maßstabsbalken = (A-C) 100 μm und (E) 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 2: Durchflusszytometrische Gating-Strategie zur Erzielung einer Population von EphB2-positiven (EphB2+) Zellen in Wildtyp-Mäusen. (A) Vorwärts- und Seitenstreudiagramme werden verwendet, um die Zellen nach ihrer Größe bzw. Granularität zu trennen. (B) Die Fluoreszenzstreuung wird verwendet, um lebensfähige Zellen entsprechend der 7-AAD (PerCP) Fluoreszenzintensität der Zellen zu trennen. Das Gate für die 7-AAD-negative Zellpopulation wurde gewählt. (C) Die Gates für die EphB2-hohen (EphB2hoch), EphB2-mittel (EphB2med), EphB2-niedrig (EphB2niedrig) und EphB2-negativen (EphB2neg) Zellpopulationen wurden ausgewählt. Abkürzungen: FSC-A = forward scatter-peak area; SSC-A = seitliche Streupeakfläche; 7-AAD = 7-Amino-Actinomycin D. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 3: Zeitlicher Verlauf des Wachstums von EphB2-Hochzell-Organoiden in Wildtyp-Mäusen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Tabelle 1: Nährmedium für eine 24-Well-Platte. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen. Ergänzendes Video S1: Zeitrafferaufnahmen eines wachsenden Organoids. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Abbildung S1: Repräsentatives Bild der Anti-Lysozym-Antikörperfärbung in einem Organoid. Die weißen Pfeile zeigen Paneth-Zellen an. Abkürzung: DIC = differentielles Interferenzkontrastmikroskop. Maßstabsbalken = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur konsistenten Isolierung von Dünndarmkrypten und der anschließenden Kultivierung von 3D-Organoiden. Um die Crypt-Releasing-Rate zu verbessern, wurde eine mechanische Isolationsmethode etabliert, bei der nach der Behandlung mit EDTA kräftig geschüttelt wird. Die Zusammensetzung des Mediums unterscheidet sich vom ursprünglichen Protokoll von Sato et al.7. Das Originalmedium ist relativ kostspielig. So sind in Tabelle 1 ein Nährmedium und maßgeschneiderte Medien für murine Dünndarmorganoide dargestellt, die pharmakologische Inhibitoren, rekombinante Wachstumsfaktoren und/oder konditionierte Medien enthalten. Wnt3A und N-Acetylcystein sind in diesem Protokoll nicht im Nährmedium enthalten. Da Paneth-Zellen Wnt3 exprimieren, produzieren die Zellen Wnt3 und unterstützen die ISC-Wartung. Außerdem wird im Zuge der Krypta-Isolation das konditionierte Medium nicht verwendet. Das Organoid-Modell ist dynamisch und weist zelluläre und strukturelle Heterogenität auf (Paneth-Zellen, Enterozyten, Becherzellen, enteroendokrine Zellen, Büschelzellen und ISCs). Daher können diese Organoide in großem Maßstab verwendet werden, um grundlegende Fragen der Organoidbiologie zu untersuchen.

Der EphB2-Gradient hält die ISC-Stammzellbildung und -Proliferation entlang der Krypten-Zotten-Achse im adulten Dünndarmaufrecht 18. Der Vorteil der Herstellung von Organoiden aus einer einzigen EphB2-Zelle im Vergleich zu isolierten Krypten liegt im Verständnis der Biologie von murinen ISCs, da ISCs eine Schlüsselrolle bei verschiedenen menschlichen Darmerkrankungen spielen. Einzelne EphB2-ISCs mit hoher Expression können kultiviert werden, um Organoide zu bilden, ähnlich wie bei der Entwicklung von Organoiden aus einzelnen Lgr5-exprimierenden ISCs. Der wichtigste Schritt besteht darin, die Zellen anhand der EphB2-Expression in den Krypten mittels FACS präzise in vier Gruppen (EphB2hoch, EphB2med, EphB2niedrig undEphB2 neg) einzuteilen. Forward- vs. Side-Scatter-Diagramme (FSC vs. SSC) werden häufig verwendet, um relevante Zellen anhand ihrer Größe und Granularität zu identifizieren. FSC gibt die Zellgröße an, und SSC bezieht sich auf die Komplexität oder Granularität der Zelle im P0-Gatter (Abbildung 2A). In dieser Arbeit wurden die Zellen, die innerhalb des definierten Gatters (P0) lagen, anschließend auf ihre Lebensfähigkeit untersucht. Als nächstes wurde ihre Viabilität anhand der negativen und positiven Populationen von 7-AAD-Fluoreszenzsignalen bestimmt. Die Grenze zwischen den 7-AAD-negativen und -positiven Zellen wurde strikt so festgelegt, dass die negativen Zellen mit minimaler positiver Zellkontamination erreicht werden. Die EphB2-Gatter wurden grob auf der Grundlage des EphB2-Graduierungsausdrucks festgelegt.

Um zu bestätigen, dass die vier Gruppen genau aufgeteilt waren, wurde die mRNA-Expression ausgewählter Gene analysiert. Die mRNA-Spiegel der ISC-Marker sindin EphB2-Zellen hoch20. Darüber hinaus sind die mRNA-Konzentrationen von Vorläuferzell-spezifischen Markern in EphB2-Med-Zellen relativ hoch20. Die EphB2-Exdpression in EphB2-armenund EphB2-neg-Zellen ist jedoch niedrig oder negativ im Vergleich zu EphB2-Hoch– und EphB2-Med-Zellen20. Die vorhergehenden Maßnahmen sollten ergriffen werden, um die Anreicherung der EphB2-hohen Zellpopulation vor der Beschichtung sicherzustellen. Ein Organoidwachstum von weniger als 6 %aus EphB2-Zellen kann jedoch auf das Absterben der Stammzellen während des Kulturprozesses zurückzuführen sein, nicht auf das starke Schütteln während der Kryptenisolierung. Es konnte gezeigt werden, dass die Applikation eines selektiven Rho-assoziierten Kinase (ROCK)-Inhibitors auf humane embryonale Stammzellen die dissoziationsinduzierte Apoptose deutlich verringert22. Daher lohnt es sich, als technische Änderung zu versuchen, den ROCK-Inhibitor in einer höheren Konzentration und mit einer längeren Inkubation zuzugeben, um die Lebensfähigkeit zu verbessern.

Wnt3A-sezernierende Paneth-Zellen neben ISCs stellen eine wesentliche Unterstützung für die ISCsdar 8. Tatsächlich weisen ISC-Paneth-Zelldubletten im Vergleich zu einzelnen ISCs eine stark erhöhte organoidbildende Kapazität auf8. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die Zugabe von Wnt3A in einer Konzentration von 100 ng/ml für die ersten 3 Tage der Kultur die organoidbildende Kapazität erhöht8. Als weitere technische Änderung könnte die Zugabe von exogenem Wnt3A die organoidbildende Kapazität einzelner EphB2-hochexprimierender ISCs verbessern.

Im Vergleich zu In-vivo-Ansätzen können Organoide leicht für genetische Manipulationen, die Analyse bösartiger Phänotypen und das Screening von Medikamenten verwendet werden20,23. Eine Kombination aus EDTA-Chelatbildung und einer mechanischen Isolationsmethode ist effektiv, reproduzierbar und zeitsparend für die Herstellung von Dünndarmorganoiden aus Krypten und kann von Labormitarbeitern ohne fortgeschrittene Erfahrung leicht befolgt werden. So kann die Hinzufügung der mechanischen Isolierung mit kräftigem Schütteln nach der Behandlung mit EDTA effizient murine Dünndarmorganoide ex vivo etablieren und ein potenzielles Werkzeug für die Organoidkultivierung und Krankheitsmodellierung anderer adulter Epithelgewebe darstellen.

Darmepithelzellen sind polarisiert und mit der apikalen Seite zum Lumen gerichtet. Die apikale Seite, die dem Lumen von 3D-Organoiden zugewandt ist, befindet sich jedoch in ihrem Inneren. Somit verhindert diese Organisation den Zugang zur apikalen Seite, was ein Problem bei der Untersuchung der Auswirkungen von luminalen Komponenten wie Nährstoffen, Mikroben und Metaboliten auf Epithelzellen darstellt. Um diesen Nachteil zu umgehen, wurde eine Kultur von Organoidzellen als 2D-Monolagen entwickelt24. In Bezug auf zukünftige Anwendungen wird die Kultur von Organoidzell-Monolagen verwendet, da dies das effizienteste und handhabbarste System darstellt.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Grants-in-Aid for Scientific Research (C) an T.T. (Förderkennzeichen JP17K07495 und JP20K06751) unterstützt. Wir danken Prof. Mineko Kengaku für die Verwendung von Geräten für die Langzeit-Zeitrafferaufnahme (LCV100; Olymp).

Materials

1.5 mL Eppendorf tube Eppendorf 0030 125.215
5 mL syringe TERUMO SS-05SZ
15 mL Falcon tube Iwaki 2325-015
20 μm cell strainer Sysmex 04-004-2325
24-well plate Iwaki 3820-024
50 mL Falcon tube Iwaki 2345-050
60 mm tissue culture dish FALCON 353002
70 μm cell strainer Falcon 352350
100 mm Petri dish Iwaki 3020-100
7-AAD BD Biosciences 559925
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634-010
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Invitrogen A-11004
Anti-EphB2 APC-conjugated antibody BD Biosciences 564699
C57BL6/J mice Japan SLC, Inc.
Clean bench HITACHI CCV-1306E
Confocal laser scanning microscope Olympus FV3000
EDTA (0.5 mol/L) Nacalai Tesque 06894-14 2 mM
FACSMelody BD Life Sciences-Biosciences 661762
Fetal bovine serum Sigma 173012 1% (v/v)
Fiji (software) https://fiji.sc/
Gentamicin (10 mg/mL) Nacalai Tesque 16672-04 25 μg/mL
Hammacher laboratory scissor SANSYO 91-1538
Incubator Panasonic MCO-170-PJ
Laboratory tweezer AS-ONE 7-164-04
L-Glutamine 200 mM Gibco 25030081 2 mM
Matrigel BD Biosciences 354230 ECM for 3D organoids
Mouse Anti-Human Lysozyme LSBio LS-B8704-100
Murine EGF (20 μg/mL stock solution) PeproTech 315-09 20 ng/mL
PBS 1x Gibco 10010-023
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140-122 50 U/mL
Pipetman (10 μL, 20 μL, 200 μL, and 1,000 μL) GILSON 1-6855-12, -13, -15, and -16
Recombinant murine Noggin (20 μg/mL stock solution R&D Systems 1967-NG-025 100 ng/mL
Recombinant murine R-Spondin 1 (250 μg/mL stock solution) R&D Systems 3474-RS-050 500 ng/mL
Sorbitol Nacalai Tesque 32021-95 2% (w/v)
TE2000-S (inverted microscope) Nikon 24131
Time-lapse image microscope Olympus LCV100
TrypLE Express 1x Gibco 12605-010
ULVAC ULVAC KIKO Inc. 100073
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Takase, Y., Fujishima, K., Takahashi, T. The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research. J. Vis. Exp. (194), e65219, doi:10.3791/65219 (2023).
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