زراعة 3D من المواد العضوية من خبايا الفئران المعوية وخلية جذعية واحدة للبحوث العضوية
Summary
وصفنا بروتوكولا لعزل خبايا الفئران المعوية الصغيرة والثقافة العضوية المعوية 3D من الخبايا. بالإضافة إلى ذلك ، وصفنا طريقة لتوليد المواد العضوية من خلية جذعية معوية واحدة في حالة عدم وجود مكانة خلوية شبه ظهارية.
Abstract
في الوقت الحاضر ، تمثل الثقافة العضوية أداة مهمة للدراسات في المختبر لمختلف الجوانب البيولوجية والأمراض في الأعضاء المختلفة. خبايا الفئران المعوية الصغيرة يمكن أن تشكل المواد العضوية التي تحاكي ظهارة الأمعاء عند استزراعها في مصفوفة 3D خارج الخلية. تتكون الكائنات العضوية من جميع أنواع الخلايا التي تؤدي وظائف استتباب الأمعاء المختلفة. وتشمل هذه الخلايا بانيث ، وخلايا الغدد الصماء المعوية ، والخلايا المعوية ، والخلايا الكأسية ، وخلايا الخصل. تضاف جزيئات جيدة التوصيف إلى وسط الاستزراع لإثراء الخلايا الجذعية المعوية (ISCs) الموسومة بتكرارات غنية بالليوسين تحتوي على مستقبلات مقترنة بالبروتين G 5 وتستخدم لدفع التمايز إلى أسفل سلالات محددة. تشمل هذه الجزيئات عامل نمو البشرة ، Noggin (بروتين مورفوجيني عظمي) ، و R-spondin 1. بالإضافة إلى ذلك ، تم أيضا تفصيل بروتوكول لتوليد المواد العضوية من مستقبلات الخلايا الكبدية B2 (EphB2) الإيجابية للإريثروبويتين. في مقالة الطرق هذه ، يتم وصف تقنيات عزل الخبايا المعوية الدقيقة و ISC واحد من الأنسجة وضمان الإنشاء الفعال للعضويات.
Introduction
ظهرت الكائنات العضوية المعوية ، التي تم تأسيسها لأول مرة في عام 2009 ، كأداة قوية في المختبر لدراسة بيولوجيا الأمعاء نظرا لتشابهها المورفولوجي والوظيفي مع الأنسجة الناضجة. في الآونة الأخيرة ، سمحت التطورات التكنولوجية في الكائنات العضوية المستزرعة المشتقة من الخلايا الجذعية للأنسجة البالغة بزراعة الخلايا الجذعية المعوية (ISCs) على المدى الطويل مع إمكانية التجديد الذاتي والتمايز. تم استخدام هذه الكائنات العضوية على نطاق واسع في الدراسات البحثية الأساسية والانتقالية حول فسيولوجيا الجهاز الهضمي والفيزيولوجيا المرضية1،2،3،4،5،6. توفر المواد العضوية ثلاثية الأبعاد التي طورتها مجموعة Clevers أداة قوية لدراسة ظهارة الأمعاء مع تحسين الأهمية الفسيولوجية7. نظرا لأن الكائنات العضوية المعوية مشتقة من الخلايا الجذعية النسيجية وتتكون من أنواع متعددة من الخلايا ، فإنها تلخص وظائف ظهارة الأمعاء. وتجدر الإشارة إلى أن الخلايا الجذعية ذات التكرارات الغنية بالليوسين المحتوية على بروتين G ذات الفرز الواحد 5 إيجابية (Lgr5 +) يمكن أن تولد أيضا عضويات ثلاثية الأبعاد بدون أي خلايا بانيث أو مكانة ISC مثل المكانة الظهارية أو مكانةاللحمية 7. ومع ذلك ، فإن قدرة تكوين الأعضاء لخلايا Lgr5 + أحادية الفرز منخفضة مقارنة بتلك الموجودة في خلايا crypt و ISC-Paneth8.
أظهر عدد متزايد من الدراسات أن طرق حضانة حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) أو تفكك الكولاجين تسبب ارتخاء في الظهارة وإطلاق الخبايا. نظرا لأن التفكك الأنزيمي قد يكون له تأثير على حالة الخلية للخبايا ، فعادة ما تستخدم طريقة العزل الميكانيكي لفصل الأنسجة. على الرغم من أن الهضم الميكانيكي هو تقنية سريعة ، إلا أن هذه الطريقة يمكن أن تترافق مع غلة سرداب غير متسقة أو ضعف صلاحية الخلية9. لذلك ، يمكن الجمع بين معالجة EDTA والتفكك الميكانيكي لتوليد عوائد سرداب أفضل. من سمات المنهجية الموضحة في هذه المقالة استخدام الاهتزاز القوي لشظايا الأنسجة بعد استخلاب EDTA10. يسمح الاهتزاز القوي بالعزل الفعال للخبايا من مجمعات الزغابات في الأمعاء الدقيقة. تحدد درجة الاهتزاز اليدوي الفصل. وبالتالي ، فإن الحصول على الخبايا من المجمعات أمر مهم للمجربين في هذا المجال. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للمهارة المناسبة تقليل تلوث الزغابات إلى الحد الأدنى وزيادة عدد الخبايا.
ومن ثم ، فإن هذا البروتوكول التجريبي ، الذي يستخدم عضويات معوية دقيقة مشتقة من مورين ، يمكن أن يعزل الخبايا بشكل أفضل بالقوة البدنية بعد العلاج ب EDTA للتفكك. من المعروف أن نمط التعبير عن مستقبلات الخلايا الكبدية المنتجة للإريثروبويتين B2 (EphB2) يعكس جزئيا بيئة السرداب. على سبيل المثال ، يتم تنظيم الخلايا الإيجابية EphB2 من أسفل إلى أعلى11. تم إجراء فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) بناء على تعبير EphB2 ، وتم تقسيم الخلايا التي تم الحصول عليها إلى أربع مجموعات: EphB2high ، EphB2med ، EphB2low ، و EphB2neg. بعد ذلك ، تم إثبات النمو العضوي من خلاياEphB2 العالية أحادية الفرز في الفئران من النوع البري (WT).
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول طريقة لعزل الخبايا المعوية الدقيقة باستمرار والثقافة اللاحقة للعضويات 3D. لتحسين معدل تحرير القبو ، تم إنشاء طريقة عزل ميكانيكية تتضمن اهتزازا قويا بعد العلاج باستخدام EDTA. يختلف التركيب المتوسط عن البروتوكول الأصلي ل Sato et al.7. الوسيلة الأصلية مكلفة نسبيا. وهكذا ، يتم عرض وسط استزراع ووسط مخصص للعضويات المعوية الدقيقة للفئران التي تحتوي على مثبطات دوائية و / أو عوامل نمو مؤتلفة و / أو وسائط مكيفة في الجدول 1. لم يتم تضمين Wnt3A و N-acetylcysteine في وسط الاستزراع في هذا البروتوكول. نظرا لأن خلايا Paneth تعبر عن Wnt3 ، تنتج الخلايا Wnt3 وتدعم صيانة مركز الدراسات الدولي. بالإضافة إلى ذلك ، أثناء عزل القبو ، لا يتم استخدام الوسيط المشروط. النموذج العضوي ديناميكي وله عدم تجانس خلوي وهيفي (خلايا بانيث ، الخلايا المعوية ، الخلايا الكأسية ، خلايا الغدد الصماء المعوية ، خلايا الخصل ، و ISCs). وبالتالي ، يمكن استخدام هذه الكائنات العضوية على نطاق واسع لدراسة القضايا الأساسية لبيولوجيا العضوي.
يحافظ تدرج EphB2 على جذع ISC وانتشاره على طول محور الزغابات المشفرة في الأمعاء الدقيقة البالغة18. تتعلق ميزة صنع المواد العضوية من خلية واحدة من خلايا EphB2 مقارنة بالخبايا المعزولة بفهم بيولوجيا ISCs الفئران ، حيث تلعب ISCs أدوارا رئيسية في مختلف الاضطرابات المعوية البشرية. يمكن استزراع ISCs أحادية EphB2عالية التعبير لتشكيل عضويات بطريقة مماثلة لتطوير الكائنات العضوية من ISCs أحادية التعبير عن Lgr5. الخطوة الأكثر أهمية هي تقسيم الخلايا بدقة إلى أربع مجموعات (EphB2high و EphB2med و EphB2low و EphB2neg) وفقا لتعبير EphB2 في الخبايا باستخدام FACS. تستخدم مخططات التشتت الأمامي مقابل الجانبي (FSC مقابل SSC) بشكل شائع لتحديد الخلايا ذات الأهمية بناء على حجمها ودقتها. يشير FSC إلى حجم الخلية ، ويتعلق SSC بتعقيد أو دقة الخلية في بوابة P0 (الشكل 2A). في هذا العمل ، تم تحليل الخلايا التي تقع داخل البوابة المحددة (P0) لاحقا للتأكد من صلاحيتها. بعد ذلك ، تم تحديد صلاحيتها وفقا للسكان السلبية والإيجابية لإشارات مضان 7-AAD. تم تحديد الحدود بين الخلايا السلبية والإيجابية 7-AAD بدقة للحصول على الخلايا السلبية مع الحد الأدنى من تلوث الخلايا الإيجابية. تم تعيين بوابات EphB2 تقريبا بناء على التعبير المتدرج EphB2.
للتأكد من أن المجموعات الأربع مقسمة بدقة ، تم تحليل تعبير mRNA للجينات المختارة. مستويات mRNA لعلامات ISC مرتفعة في خلايا EphB2العالية 20. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مستويات mRNA للعلامات الخاصة بالخلايا السلفية مرتفعة نسبيا في خلايا EphB2med 20. ومع ذلك ، فإن ضغط EphB2 في خلايا EphB2المنخفضة وخلاياEphB2 neg منخفض أو سلبي مقارنة بخلايا EphB2العالية و EphB2med 20. يجب اتخاذ التدابير السابقة لضمان إثراء الخلاياالعالية EphB2 قبل الطلاء. ومع ذلك ، قد يكون النمو العضوي لأقل من 6٪ من الخلاياالعالية EphB2 بسبب موت الخلايا الجذعية أثناء عملية الاستزراع ، وليس الاهتزاز القوي أثناء عزل القبو. لقد ثبت أن تطبيق مثبط كيناز انتقائي مرتبط ب Rho (ROCK) على الخلايا الجذعية الجنينية البشرية يقلل بشكل ملحوظ من موت الخلايا المبرمج الناجم عنالتفكك 22. وبالتالي ، كتغيير تقني ، يجدر محاولة إضافة مثبط ROCK بتركيز أعلى ومع حضانة أطول لتحسين الجدوى.
توفر خلايا Paneth المفرزة Wnt3A بجوار ISCs الدعم الأساسي لISCs 8. في الواقع ، تظهر مضاعفة خلايا ISC-Paneth قدرة تشكيل عضوية متزايدة بشدة مقارنة بISCs 8 المفردة. علاوة على ذلك ، فقد تبين أن إضافة Wnt3A بتركيز 100 نانوغرام / مل لأول 3 أيام من الاستزراع تزيد من قدرة تكوين المواد العضوية8. وبالتالي ، كتغيير تقني آخر ، يمكن أن تؤدي إضافة Wnt3A الخارجية إلى تحسين قدرة تكوين الأعضاء ل ISCs أحادية EphB2عالية التعبير.
بالمقارنة مع النهج في الجسم الحي ، يمكن استخدام المواد العضوية بسهولة للتلاعب الجيني ، وتحليل الأنماط الظاهرية للأورام الخبيثة ، وفحص الأدوية20,23. مزيج من استخلاب EDTA وطريقة العزل الميكانيكي فعال وقابل للتكرار وفعال من حيث الوقت لإنشاء عضويات معوية صغيرة من الخبايا ويمكن متابعتها بسهولة من قبل موظفي المختبر دون أي خبرة متقدمة. وبالتالي ، فإن إضافة العزل الميكانيكي مع اهتزاز قوي بعد العلاج باستخدام EDTA يمكن أن ينشئ بكفاءة عضويات معوية صغيرة خارج الجسم الحي ويوفر أداة محتملة للزراعة العضوية ونمذجة الأمراض للأنسجة الظهارية البالغة الأخرى.
الخلايا الطلائية المعوية مستقطبة وموجهة مع توجيه الجانب القمي نحو التجويف. ومع ذلك ، فإن الجانب القمي الذي يواجه تجويف المواد العضوية 3D موجود في داخلها. وبالتالي ، تمنع هذه المنظمة الوصول إلى الجانب القمي ، وهي مشكلة عند دراسة تأثيرات المكونات اللمعية ، مثل العناصر الغذائية والميكروبات والمستقلبات على الخلايا الظهارية. للتحايل على هذا العيب ، تم تطوير ثقافة الخلايا العضوية كطبقة أحادية2D 24. فيما يتعلق بالتطبيقات المستقبلية ، سيتم استخدام ثقافة الخلايا العضوية أحادية الطبقات ، لأن هذا يمثل النظام الأكثر كفاءة وقابلية للسحب.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المنح في المعونة للبحث العلمي (C) إلى T.T. (أرقام المنح JP17K07495 و JP20K06751). نشكر البروفيسور مينيكو كينغاكو على استخدام المعدات اللازمة للتصوير بفاصل زمني طويل المدى (LCV100; أوليمبوس).
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 0030 125.215 | |
| 5 mL syringe | TERUMO | SS-05SZ | |
| 15 mL Falcon tube | Iwaki | 2325-015 | |
| 20 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2325 | |
| 24-well plate | Iwaki | 3820-024 | |
| 50 mL Falcon tube | Iwaki | 2345-050 | |
| 60 mm tissue culture dish | FALCON | 353002 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 100 mm Petri dish | Iwaki | 3020-100 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-11004 | |
| Anti-EphB2 APC-conjugated antibody | BD Biosciences | 564699 | |
| C57BL6/J mice | Japan SLC, Inc. | ||
| Clean bench | HITACHI | CCV-1306E | |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| EDTA (0.5 mol/L) | Nacalai Tesque | 06894-14 | 2 mM |
| FACSMelody | BD Life Sciences-Biosciences | 661762 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 173012 | 1% (v/v) |
| Fiji (software) | https://fiji.sc/ | ||
| Gentamicin (10 mg/mL) | Nacalai Tesque | 16672-04 | 25 μg/mL |
| Hammacher laboratory scissor | SANSYO | 91-1538 | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170-PJ | |
| Laboratory tweezer | AS-ONE | 7-164-04 | |
| L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030081 | 2 mM |
| Matrigel | BD Biosciences | 354230 | ECM for 3D organoids |
| Mouse Anti-Human Lysozyme | LSBio | LS-B8704-100 | |
| Murine EGF (20 μg/mL stock solution) | PeproTech | 315-09 | 20 ng/mL |
| PBS 1x | Gibco | 10010-023 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | 50 U/mL |
| Pipetman (10 μL, 20 μL, 200 μL, and 1,000 μL) | GILSON | 1-6855-12, -13, -15, and -16 | |
| Recombinant murine Noggin (20 μg/mL stock solution | R&D Systems | 1967-NG-025 | 100 ng/mL |
| Recombinant murine R-Spondin 1 (250 μg/mL stock solution) | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/mL |
| Sorbitol | Nacalai Tesque | 32021-95 | 2% (w/v) |
| TE2000-S (inverted microscope) | Nikon | 24131 | |
| Time-lapse image microscope | Olympus | LCV100 | |
| TrypLE Express 1x | Gibco | 12605-010 | |
| ULVAC | ULVAC KIKO Inc. | 100073 | |
| Y-27632 | Fujifilm | 331752-47-7 | 10 μM |
References
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Seidlitz, T., et al. Human gastric cancer modelling using organoids. Gut. 68 (2), 207-217 (2019).
- Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
- Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27, R99-R107 (2018).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. Organoid models of human gastrointestinal development and disease. Gastroenterology. 150 (5), 1098-1112 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).
- Aronowitz, J. A., Lockhart, R. A., Hakakian, C. S. Mechanical versus enzymatic isolation of stromal vascular fraction cells from adipose tissue. Springerplus. 4 (1), 713 (2015).
- Takahashi, T. New trends and perspectives in the function of non-neuronal acetylcholine in crypt-villus organoids in mice. Methods in Molecular Biology. 1576, 145-155 (2019).
- Batlle, E., et al. β-catenin and TCF mediate cell positioning in the intestinal epithelium by controlling the expression of EphB/ephrinB. Cell. 111 (2), 251-263 (2002).
- Baghdadi, M. B., Kim, T. -. H. Analysis of mouse intestinal organoid culture with conditioned media isolated from mucosal enteric glial cells. STAR Protocols. 3 (2), 101351 (2022).
- Takahashi, T., et al. Non-neuronal acetylcholine as an endogenous regulator of proliferation and differentiation of Lgr5-positive stem cells in mice. FEBS Journal. 281 (20), 4672-4690 (2014).
- Barker, N. Adult intestinal stem cells: Critical drivers of epithelial homeostasis and regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 19-33 (2014).
- Fordham, R. P., et al. Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury. Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).
- Miyoshi, H., et al. Wnt5a potentiates TGF-β signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. NatureMedicine. 17 (10), 1225-1227 (2011).
- Merlos-Suárez, A., et al. The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse. Cell Stem Cell. 8 (5), 511-524 (2011).
- Mao, W., et al. EphB2 as a therapeutic antibody drug target for the treatment of colorectal cancer. Cancer Research. 64 (3), 781-788 (2004).
- Takahashi, T., et al. Muscarinic receptor M3 contributes to intestinal stem cell maintenance via EphB/ephrin-B signaling. Life Science Alliance. 4 (9), e202000962 (2021).
- Jung, P., et al. Isolation of human colon stem cells using surface expression of PTK7. Stem Cell Reports. 5 (6), 979-987 (2015).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Schulte, L., Hohwieler, M., Müller, M., Klaus, J. Intestinal organoids as a novel complementary model to dissect inflammatory bowel disease. Stem Cells International. 2019, 8010645 (2019).
- Puzan, M., Hosic, S., Ghio, C., Koppes, A. Enteric nervous system regulation of intestinal stem cell differentiation and epithelial monolayer function. Scientific Reports. 8 (1), 6313 (2018).
