Obtener una A con las 3C: Captura de conformación cromosómica para estudiantes universitarios

1. Diseño de imprimación NOTA: Las herramientas de diseño de imprimaciones 3C están disponibles en línea28. Alternativamente, los estudiantes pueden diseñar cartillas personalizadas (ver más abajo). Identificación de ubicaciones de imprimaciónAbra el Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/), seleccione el organismo de estudio y busque la región del genoma que se evaluará utilizando 3C. En la siguiente ventana, active la pista de enzimas en la pestaña Mapeo y secuenciación debajo del navegador haciendo clic en Restr Enzymes. Introduzca la(s) enzima(s) de restricción que se van a utilizar y establezca el modo de visualización en empaquetar. Haga clic en Enviar. En Variación y repeticiones, asegúrese de que RepeatMasker esté configurado en denso. Usando los sitios de restricción como guías, identifique los sitios de interés que no estén dentro de las regiones de repetición enmascaradas (barras negras). Resalte 300 pares de bases (pb) flanqueando la secuencia aguas arriba y aguas abajo que rodea el sitio de restricción haciendo clic en la posición (pista superior) y arrastrando a la longitud deseada (~600 pb). Suelte el ratón y aparecerá un cuadro emergente. Tome nota de la ubicación genómica, haga clic en Acercar y deje que el navegador se reajuste a la selección. Pase el mouse sobre la pestaña Ver en la cinta superior del navegador y, en el menú desplegable, seleccione ADN. Deje la opción predeterminada, tenga en cuenta la designación de secuencias enmascaradas (hay una opción para convertirlas en N). Haga clic en obtener ADN. La secuencia resaltada se mostrará en la ventana. Copie y pegue esta secuencia en Primer3 (https://primer3.ut.ee/). Usando la configuración predeterminada de Primer3, genere imprimaciones haciendo clic en Recoger imprimaciones. En los resultados, tome nota de la ubicación de la enzima de restricción y seleccione cebadores que creen un producto de PCR de 200-500 pb con el sitio de restricción ubicado en el medio. Siguiendo estos pasos, diseñe imprimaciones de prueba de 1 kilobase (kb), 2 kb, 5 kb, 10 kb y 20 kb del sitio o sitios de interés. Para diseñar los cebadores de control de entrada, repita estos pasos para un sitio de 1-2 kB del sitio de interés que carece de un sitio de restricción, lo que significa que nunca se corta. Validación de imprimación funcionalPara validar la funcionalidad del cebador, configure reacciones de PCR utilizando concentraciones de cebador tituladas y ADN genómico purificado. Ya sea a través de medios cuantitativos o semicuantitativos, determine si los cebadores crean el producto esperado. Rediseñe los cebadores que no superan la validación. 2. Día 1 NOTA: El protocolo puede pausarse (congelarse a -20 °C) después de la reticulación de la cromatina y después de la recolección de núcleos. Los pasos toman, en promedio, 5-6 h con estudiantes universitarios. Colección de núcleos de C. elegans para adultos jóvenes (YA) (adaptado de Han et al.29)Reticulación de cromatinaRecolectar 5,000 gusanos YA en 30 ml de medio M9 en un tubo cónico de 50 ml, y girar a 400 × g durante 2 min a temperatura ambiente (RT). Lave el pellet de lombriz 3 veces más con M9 para eliminar las bacterias. Retirar el sobrenadante, resuspender el gránulo de lombriz en 47,3 ml de M9 que contenga 2,7 ml de formaldehído al 37% (2% final) e incubar con agitación (balanceo o nutación) durante 30 min a RT.PRECAUCIÓN: Manipule el formaldehído con cuidado y trabaje bajo una campana extractora con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio de EPP, guantes adecuados y protección para los ojos). El formaldehído es un irritante que afecta los ojos, la nariz, la garganta y los pulmones. Girar los gusanos a 400 × g durante 2 min en RT. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de lombriz en 50 ml de glicina 1 M. Girar los gusanos a 400 × g durante 2 minutos en RT. Colección NucleiResuspender el pellet de lombriz en 6 ml de tampón NP refrigerado (50 mM HEPES a pH 7.5, 40 mM NaCl, 90 mM KCl, 2 mM EDTA, 0.5mM EGTA, 0.1% Tween 20, 0.2 mM DTT, 0.5 mM espermidina, 0.25 mM espermina, 1x inhibidor completo de la proteasa). Transfiera la suspensión de tornillo sin fin a un ajuste holgado de 7 ml Rebote en hielo. Rebote la muestra 15 veces y mantenga el hielo durante 5 minutos. Transfiera la suspensión de tornillo sin fin a un ajuste ajustado de 7 ml Rebote sobre hielo. Beba la muestra 20 veces y mantenga el hielo durante 5 minutos. Transfiera la suspensión de gusanos a un tubo cónico limpio de 15 ml y agregue tampón NP a 10 ml en total (aproximadamente 4 ml). Vórtice la suspensión del tornillo sin fin en un ajuste alto durante 30 s. Incubar la muestra en hielo durante 5 min. Repita el paso anterior. Girar la suspensión de gusanos a 100 × g durante 5 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un tubo cónico fresco de 15 ml. Revise la muestra en busca de restos de gusanos. Visualice 10 μL de la muestra con un microscopio óptico. Si hay restos de lombriz, hilar la muestra a 2.000 × g durante 5 min a 4 °C, resuspender el pellet en un tampón de NP de 10 ml frescos y volver a girar la muestra a 100 × g durante 5 min a 4 °C. Deseche el pellet, revise el sobrenadante en busca de restos de gusanos y repita hasta que la muestra esté libre de restos de gusanos.NOTA: Alternativamente, los restos de gusanos también se pueden eliminar colando la muestra a través de un filtro de células de 40 μm (6x) seguido de un filtro de células de 20 μm (6x). Si la muestra está libre de restos de gusanos, tome 5 μL de la muestra, agregue 5 μL de pironina verde de metilo (los núcleos serán azules) y cuente los núcleos con un hemocitómetro. Girar la muestra a 2.000 × g durante 5 min a 4 °C Retire el sobrenadante, coloque las muestras en hielo y proceda; alternativamente, congele rápidamente los núcleos y guárdelos a -80 °C. Digestión de la cromatinaResuspender los núcleos en 450 μL de agua limpia. Transfiera los núcleos a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml. A la muestra reticulada, agregue 60 μL de tampón de la enzima de restricción DpnII 10x y mezcle bien.NOTA: Se pueden usar otras enzimas de restricción que aún cortan el ADN reticulado. Añadir 15 μL de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10% para permeabilizar los núcleos, e incubar con agitación (balanceo o nutación) a 37 °C durante 1 h.PRECAUCIÓN: SDS es un irritante y es tóxico si se ingiere o absorbe a través de la piel. Manéjelo con cuidado y use el EPP adecuado (bata de laboratorio, guantes adecuados y protección para los ojos). Apagar la SDS añadiendo 75 μL de Triton X-100 al 20% e incubando con agitación a 37 °C durante 1 h. Tomar 10 μL de la muestra como control no digerido. Conservar a 4 °C. Añadir 400 U de DpnII, e incubar a 37 °C durante la noche con agitación. 3. Día 2 NOTA: En promedio, los estudiantes universitarios tardan 5 horas en completar estos pasos. Digestión de la cromatinaAñadir 200 U adicionales de DpnII e incubar las muestras durante 4 h a 37 °C con agitación para asegurar la digestión completa de la muestra reticulada. Tomar una alícuota de 10 μL de las muestras como control de la digestión. Inactivar térmicamente la enzima de restricción incubando la muestra durante 20 minutos a 65 °C (o según las instrucciones del fabricante). Continúe con el paso 2.1.3. Si la enzima no puede ser inactivada por calor, añadir 80 μL de SDS al 10% e incubar la muestra durante 30 min a 65 °C. Luego, agregue 375 μL de Triton X-100 al 20% y mezcle girando. Incubar la muestra durante 1 h a 37 °C y continuar hasta el paso 2.2. Ligadura de cromatinaTransfiera la muestra a un tubo cónico limpio de 50 ml, ajuste el volumen de la muestra a 5,7 ml con H2O de grado molecular y mezcle girando. Agregue 700 μL de tampón 10x T4 Ligase y mezcle girando. Agregue 60 U de T4 DNA Ligasea y mezcle girando. Incubar durante la noche a 16 °C. 4. Día 3 NOTA: En promedio, los estudiantes universitarios tardan de 15 a 30 minutos en completar estos pasos. Después de la incubación nocturna, las muestras se pueden congelar. Digestión de proteínas y reticulación inversaAñadir 30 μL de proteinasa K (10 mg/ml) a la muestra de 3C e incubar a 65 °C durante la noche con agitación. Añadir 5 μL de proteinasa K (10 mg/ml) al control no digerido y de digestión, e incubar a 65 °C durante la noche con agitación. 5. Día 4 NOTA: En promedio, los estudiantes universitarios tardan 4-5 h en completar estos pasos. Purificación de la biblioteca 3CAgregue 30 μL de RNasa A (10 mg/ml) a la muestra de 3C y agite para mezclar. Incubar la muestra durante 45 min a 37 °C. Añadir 7 ml de fenol-cloroformo a la muestra y mezclar agitando.PRECAUCIÓN: El fenol-cloroformo es un irritante de la piel y los ojos y puede causar quemaduras si no se trata el contacto. El fenol-cloroformo debe usarse en una campana extractora con protección ocular y guantes (nitrilo) adecuados. Centrifugar la muestra durante 15 min a 3.270 × g a RT. Recoger la fase acuosa y transferir a un tubo cónico limpio de 50 ml. Agregue volúmenes iguales de cloroformo y mezcle la muestra agitándola. Centrifugar la muestra durante 15 min a 3.270 × g a RT. Recoger la fase acuosa y transferir a un tubo cónico limpio de 50 ml. Agregue 7.5 ml de H2O de grado molecular, 35 ml de etanol al 100% y (opcional) 7 μL de glucógeno (1 mg / ml). Mezclar agitando e incubar a -80 °C hasta que la muestra esté congelada.NOTA: La muestra puede tardar 1 h o más en congelarse. El protocolo se puede pausar aquí.Mientras la muestra 3C se congela, purifique las muestras de control. A las muestras de control, ajustar el volumen a 500 μL con agua de grado molecular y añadir 2 μL de mezcla de RNasa A (10 mg/ml) moviendo el tubo. Gire brevemente para recoger la muestra en el fondo del tubo. Incubar las muestras durante 45 min a 37 °C. A las muestras de control, añadir 1 mL de fenol-cloroformo, y mezclar agitando los tubos. Centrifugar la muestra durante 15 min a 3.270 × g en RT. Recoger la fase acuosa de los controles, y colocar en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml. Agregue volúmenes iguales de cloroformo y mezcle la muestra agitándola. Centrifugar la muestra durante 15 min a 3.270 × g en RT. Recoger la fase acuosa de los controles, y colocar en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml. Añadir 1 mL de etanol al 100% y 2 μL de glucógeno (1 mg/mL). Mezclar agitando e incubar a −80 °C durante 30 min. Centrifugar la muestra durante 15 min a 3.270 × g a 4 °C. Retire el sobrenadante y agregue 750 μL de etanol refrigerado al 70%. Centrifugar la muestra durante 10 min a 3.270 × g a 4 °C. Retire el sobrenadante y seque las muestras al aire. Vuelva a suspender el pellet en 50 μL deH2Ode grado molecular. Congele o continúe con el paso 6. Centrifugar la muestra durante 60 min a 3.270 × g a 4 °C. Retire el sobrenadante y agregue 10 ml de etanol refrigerado al 70%. Interrumpa y rompa la bolita de ADN agitando la muestra para mezclarla. Centrifugar la muestra durante 30 min a 3.270 × g a 4 °C. Retire el sobrenadante y deje que la muestra se seque parcialmente al aire a RT. Resuspender el pellet en 150 μL de Tris-HCl de 10 mM (pH 7.5) pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Esta es la “Biblioteca 3C”.NOTA: Congele la muestra o continúe con el análisis. 6. Día 5 NOTA: En promedio, los estudiantes universitarios tardan 1-2 h en completar estos pasos. Determinación de la calidad de la muestra utilizando la curva estándar del cebador de controlCuantificar la concentración de ADN para la muestra de 3C, así como todos los controles, y ajustar las muestras a 30 μg/μL (si las concentraciones lo permiten). En serie, las muestras diluidas se duplican cuatro veces, lo que resulta en cinco diluciones para cada muestra (1x, 0.5x, 0.25x, 0.125x, 0.0625x).NOTA: Si la cuantificación no se puede hacer fácilmente, diluya en serie las muestras como se indicó anteriormente y proceda. Configure las reacciones de PCR para el 3C, el control genómico y el control digerido para cada muestra diluida con los cebadores de control: 1 μL de ADN, 10 μL de tampón de reacción 5x, 1 μL de dNTP de 10 mM, 1 μL de cebador de control de 10 mM (mezclado hacia adelante e inverso), 1 μL de polimerasa Taq y 36 μL de agua. Siguiendo las instrucciones del software específico de la máquina de PCR, configure el programa de PCR de curva estándar utilizando las siguientes condiciones de ciclismo: 30 s a 98 °C; 30 ciclos de 5 s a 98 °C, 5 s a 60 °C y 10 s a 72 °C; 1 min a 72 °C; Retención a 4 °C. Usando el software, genere las curvas estándar para las muestras. Después de que el software genere la curva, tome nota de la eficiencia de PCR y el valor de R2 . Determinación de la concentración de ADNPara determinar la concentración de ADN de las muestras de 3C, compare las muestras con una muestra de ADN genómico de concentración conocida. Diluir las muestras a 30 ng/μL y diluir en serie el control genómico de 10 ng/μL a 0,01 ng/μL en dos pasos para crear una curva estándar.NOTA: Si la cuantificación no se puede hacer fácilmente, diluya la muestra 1:10 y continúe. Configure las reacciones de PCR para el 3C, el control genómico y el control digerido para cada muestra diluida con los cebadores de control: 1 μL de ADN, 10 μL de tampón de reacción 5x, 1 μL de 10 mM dNTPs, 1 μL de cebador de control de 10 mM (mezcla directa e inversa), 1 μL de polimerasa Taq y 36 μL de agua. Siguiendo las instrucciones del software específico para la máquina de PCR, configure el programa de PCR de curva estándar utilizando las siguientes condiciones de ciclismo: 30 s a 98 °C; 30 ciclos de 5 s a 98 °C, 5 s a 60 °C y 10 s a 72 °C; 1 min a 72 °C; Retención a 4 °C. Usando el software, genere las curvas estándar para las muestras, trazando las muestras 3C en la curva. Compare la posición de la abundancia de muestras de 3C con la curva estándar creada por las reacciones del ADN genómico de concentración conocida, y ajuste las muestras de 3C a 30 ng / μL. Determinar la presencia o ausencia de interacción cromatinaConfigure reacciones de qPCR con 30 ng de la muestra 3C, la muestra de control genómico y la muestra de control digerida: 1 μL de ADN, 10 μL de tampón de reacción 5x, 1 μL de dNTP de 10 mM, 1 μL de cebador de 10 mM (mezclado hacia adelante e inverso), 1 μL de polimerasa Taq y 36 μL de agua.NOTA: Las reacciones deben configurarse utilizando el cebador de control, los cebadores de prueba para loci genómicos individuales y las combinaciones deseadas de los cebadores de prueba (sitio “a” hacia adelante y sitio “b” hacia atrás) que se utilizan para determinar la interacción de la cromatina (Figura 3). Siguiendo las instrucciones para el software de la máquina de PCR, configure el programa de PCR de la siguiente manera: 30 s a 98 °C; 40 ciclos de 5 s a 98 °C, 5 s a 60 °C y 10 s a 72 °C; 1 min a 72 °C; Retención a 4 °C. Después de ejecutar la PCR, inspeccione la gráfica de amplificación. Asegúrese de que las reacciones de PCR muestren una amplificación exponencial, duplicando cada ciclo.NOTA: Las reacciones que no muestran amplificación exponencial no se pueden analizar más a fondo. Siguiendo las instrucciones para el software de la máquina de PCR, defina el umbral del experimento de qPCR. Exporte los valores de Ct para todas las muestras. Determine la eficiencia de digestión utilizando los valores de Ct del cebador de prueba (TP) y del cebador de control (CP) de las muestras de control no digerido (UC) y control digerido (DC) utilizando la ecuación (1).Porcentaje digerido = 100 – (1) Estos valores deben estar en el rango de 80% -90% de digestión. Registre estos valores (Figura 4A). Determine la interacción relativa de la cromatina utilizando la combinación de cebador de prueba (TPC) y los valores de Ct del cebador de control (CP) de las muestras de control no digerido (UC) y 3C (3C) utilizando la ecuación (2).Interacción cromatina = 100 – (2) Trazar los valores de cada muestra en un gráfico de barras para cada combinación de cebador de prueba. Compare la señal de las muestras 3C con las muestras de control para determinar si la muestra de 3C tiene enriquecimiento de una interacción de cromatina particular sobre las muestras de control. Las muestras de 3C que muestran enriquecimiento sobre el control pueden considerarse condicionalmente positivas y requieren validación mediante secuenciación de Sanger (Figura 4B).NOTA: Al analizar los datos del gráfico, es importante recordar que a menos que se use una “plantilla de control” (ver discusión), la abundancia entre reacciones (es decir, de un conjunto de cebadores al siguiente) no se puede comparar. Identificación de los productos 3CEjecute los productos de PCR en un gel de agarosa al 1,5%. Visualice el gel para el tamaño correcto de los productos de PCR utilizando una caja de luz UV o un sistema de documentación de gel.NOTA: Las bibliotecas 3C bien construidas contendrán una amplia gama de fragmentos de ADN, y a pesar de la validación previa de los cebadores para la especificidad, las reacciones de PCR de las bibliotecas 3C tienen el potencial de contener muchas bandas (Figura 5A). Esto no impide el análisis de las bibliotecas 3C. Extirpar las bandas de producto correspondientes al tamaño de fragmento esperado, y realizar la extracción en gel de los productos de PCR siguiendo las instrucciones de un kit comercial o el protocolo casero que se describe a continuación.PRECAUCIÓN: La luz UV es un carcinógeno conocido, y se debe tener mucho cuidado para limitar el tiempo expuesto a la luz UV. Se debe usar protección ocular resistente a los rayos UV, un protector de muestras, guantes y una bata de laboratorio.Para construir un cartucho de purificación casero, haga un agujero en el fondo de un tubo de 0,5 ml con una aguja. Empaque una pequeña cantidad de algodón de una bola de algodón en el fondo del tubo de 0.5 ml, llenando no más de la mitad del tubo. Coloque el tubo de 0.5 ml en un tubo de 1.5 ml; Asegúrese de que el tubo más pequeño descanse sobre el borde del tubo más grande, no en el tubo. Corte con cuidado un fragmento de gel en trozos más pequeños y colóquelo en el tubo de 0,5 ml del cartucho. Coloque el conjunto en un congelador de −20 °C durante 5 min. Gire el conjunto durante 3 minutos a 13.000 × g a RT. Mantenga el tubo de 1,5 ml con el ADN extraído en tampón y deseche el tubo de 0,5 ml que contiene los restos de agarosa. El ADN purificado se puede enviar para la secuenciación de Sanger utilizando cebadores directos e inversos para el fragmento 3C. Identificación de contactos de cromatina mediante BlatUna vez completada la secuenciación, determinar si las muestras cumplen con los estándares de control de calidad indicados en el informe de secuenciación. Para las secuencias que pasan el control de calidad, abra los archivos .seq y .ab1 (seguimiento) en un programa de edición de secuenciación como Another Plasmid Editor (ApE), inspeccione el archivo .ab1 en busca de picos de llamada base claros y edite los picos mal llamados en el archivo .seq. Con el archivo .seq editado, busque el sitio DpnII. Dependiendo del resultado de la secuencia, esto debería estar a mitad de camino en la secuencia reportada. Para determinar si la secuencia es la secuencia objetivo esperada, resalte el sitio DpnII y un adicional de 30-50 pb de la secuencia aguas arriba correspondiente al cebador directo de los loci genómicos probados para 3C. Realice una búsqueda Blat de esta secuencia contra la especie objetivo. Asegúrese de que los loci genómicos coincidan con los del cebador. Repita el paso anterior para la secuencia inversa del cebador, asegurándose de que el locus genómico devuelto coincida con el del cebador inverso.