3C'lerle A Almak: Lisans Öğrencileri için Kromozom Konformasyon Yakalama

1. Astar tasarımı NOT: 3C astarlar tasarım araçları çevrimiçi olarak mevcuttur28. Alternatif olarak, özel astarlar öğrenciler tarafından tasarlanabilir (aşağıya bakınız). Astar konumlarının belirlenmesiUCSC Genom Tarayıcısını (http://genome.ucsc.edu/) açın, çalışmanın organizmasını seçin ve 3C kullanılarak değerlendirilecek genomun bölgesini arayın. Bir sonraki pencerede, Restr Enzimleri’ne tıklayarak tarayıcının altındaki Haritalama ve Sıralama sekmesindeki enzim izini etkinleştirin. Kullanılacak kısıtlama enzimini (enzimlerini) girin ve görüntüleme modunu paketle olarak ayarlayın. Gönder’e tıklayın. Varyasyon ve Tekrarlar’da, RepeatMasker’ın yoğun olarak ayarlandığından emin olun. Kısıtlama sitelerini kılavuz olarak kullanarak, maskelenmiş yinelenen bölgelerde (siyah çubuklar) bulunmayan ilgi çekici siteleri belirleyin. Konuma (en üstteki parça) tıklayarak ve istenen uzunluğa (~600 bp) sürükleyerek kısıtlama bölgesini çevreleyen hem yukarı hem de aşağı akış sırasını çevreleyen 300 temel çifti (bp) vurgulayın. Fareyi bıraktığınızda bir açılır kutu görünecektir. Genomik konumu not alın, Yakınlaştır’a tıklayın ve tarayıcının seçime yeniden uyum sağlamasına izin verin. Fareyi üst tarayıcı şeridindeki Görünüm sekmesinin üzerine getirin ve açılır menüden DNA’yı seçin. Varsayılan seçeneği bırakın, maskelenmiş dizilerin atanmasına dikkat edin (bunları N’ler yapmak için bir seçenek vardır). DNA al’a tıklayın. Vurgulanan sıra daha sonra pencerede görüntülenecektir. Bu sırayı kopyalayıp Primer3’e (https://primer3.ut.ee/) yapıştırın. Primer3 varsayılan ayarlarını kullanarak, Astarları seç’e tıklayarak astarlar oluşturun. Sonuçlarda, kısıtlama enziminin yerini not alın ve ortada bulunan kısıtlama bölgesi ile 200-500 bp PCR ürünü oluşturan primerleri seçin. Bu adımları izleyerek, ilgili site(ler)den 1 kilobase (kb), 2 kb, 5 kb, 10 kb ve 20 kb tasarım testi primerleri alın. Giriş denetimi astarlarını tasarlamak için, bu adımları, kısıtlama sitesi olmayan, yani hiçbir zaman kesilmeyen, ilgilenilen siteden 1-2 kB uzaklıktaki bir site için tekrarlayın. İşlevsel astar doğrulamasıPrimer işlevselliğini doğrulamak için, titre primer konsantrasyonları ve saflaştırılmış genomik DNA kullanarak PCR reaksiyonları ayarlayın. Kantitatif veya yarı kantitatif araçlarla, primerlerin beklenen ürünü oluşturup oluşturmadığını belirleyin. Doğrulamada başarısız olan astarları yeniden tasarlayın. 2. Gün 1 NOT: Protokol, kromatin çapraz bağlanmasından sonra ve çekirdek toplanmasından sonra duraklatılabilir (-20 °C’de dondurulabilir). Adımlar, lisans öğrencileri ile ortalama 5-6 saat sürer. Genç-yetişkin (YA) C. elegans çekirdekleri koleksiyonu (Han et al.29’dan uyarlanmıştır)Kromatin çapraz bağlama50 mL’lik bir konik tüpte 30 mL M9 ortamında 5.000 YA solucanı toplayın ve oda sıcaklığında (RT) 2 dakika boyunca 400 × g’da döndürün. Bakterileri temizlemek için solucan peletini M9 ile 3 kat daha fazla yıkayın. Süpernatanı çıkarın, solucan peletini 2.7 mL% 37 formaldehit (% 2 nihai) içeren 47.3 mL M9’da yeniden askıya alın ve RT’de 30 dakika boyunca ajitasyon (sallanma veya besleyicilik) ile inkübe edin.DİKKAT: Formaldehiti dikkatli kullanın ve uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla (KKD laboratuvar önlüğü, uygun eldivenler ve göz koruması) duman davlumbazının altında çalışın. Formaldehit, gözleri, burnu, boğazı ve akciğerleri etkileyen tahriş edici bir maddedir. Solucanları RT’de 2 dakika boyunca 400 × g’da döndürün. Süpernatanı çıkarın ve solucan peletini 50 mL 1 M glisin içinde yeniden askıya alın. Solucanları RT’de 2 dakika boyunca 400 × g’da döndürün. Çekirdek koleksiyonuSolucan peletini 6 mL soğutulmuş NP tamponunda (pH 7,5’te 50 mM HEPES, 40 mM NaCl, 90 mM KCl, 2 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, %0,1 Tween 20, 0,2 mM DTT, 0,5 mM spermidin, 0,25 mM spermin, 1x tam proteaz inhibitörü) yeniden askıya alın. Sonsuz süspansiyonu buz üzerinde 7 mL’lik gevşek bir Sıçramaya aktarın. Numuneyi 15x zıplayın ve 5 dakika boyunca buz üzerinde tutun. Sonsuz süspansiyonu buz üzerinde 7 mL’lik sıkı oturan bir Sıçramaya aktarın. Numuneyi 20x zıplayın ve 5 dakika boyunca buz üzerinde tutun. Sonsuz süspansiyonu temiz bir 15 mL konik tüpe aktarın ve NP tamponunu toplamda 10 mL’ye (yaklaşık 4 mL) ekleyin. Solucan süspansiyonunu 30 s boyunca yüksek bir ayarda vorteks. Numuneyi buz üzerinde 5 dakika boyunca inkübe edin. Önceki adımı yineleyin. Sonsuz süspansiyonu 100 × g’da 4 °C’de 5 dakika boyunca döndürün. Süpernatantı taze bir 15 mL konik tüpe aktarın. Numunede solucan kalıntıları olup olmadığını kontrol edin. Numunenin 10 μL’sini ışık mikroskobu ile görselleştirin. Solucan kalıntıları varsa, numuneyi 4 °C’de 5 dakika boyunca 2.000 × g’da döndürün, peleti taze 10 mL NP tamponunda yeniden askıya alın ve numuneyi 4 ° C’de 5 dakika boyunca 100 × g’da tekrar döndürün. Peletleri atın, süpernatantı solucan kalıntıları açısından kontrol edin ve numune solucan kalıntılarından arındırılana kadar tekrarlayın.NOT: Alternatif olarak, solucan kalıntıları, numuneyi 40 μm’lik bir hücre süzgecinden (6x) ve ardından 20 μm’lik bir hücre süzgecinden (6x) süzerek de giderilebilir. Numune solucan kalıntılarından arındırılmışsa, numunenin 5 μL’sini alın, 5 μL metil yeşil pironin ekleyin (çekirdekler mavi olacaktır) ve çekirdekleri bir hemositometre ile sayın. Numuneyi 4 °C’de 5 dakika boyunca 2.000 × g’da döndürün Süpernatanı çıkarın, örnekleri buzun üzerine yerleştirin ve devam edin; alternatif olarak, çekirdekleri tutturun ve -80 ° C’de saklayın. Kromatin sindirimiÇekirdekleri 450 μL temiz suda tekrar askıya alın. Çekirdekleri temiz bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Çapraz bağlı numuneye, 60 μL 10x DpnII kısıtlama enzim tamponu ekleyin ve iyice karıştırın.NOT: Çapraz bağlı DNA’yı hala kesen diğer kısıtlama enzimleri kullanılabilir. Çekirdekleri geçirgenleştirmek için 15 μL% 10 sodyum dodesil sülfat (SDS) ekleyin ve 1 saat boyunca 37 ° C’de ajitasyon (sallanma veya nutlama) ile inkübe edin.DİKKAT: SDS tahriş edicidir ve cilt yoluyla yutulursa veya emilirse toksiktir. Dikkatli kullanın ve uygun KKD’yi (laboratuvar önlüğü, uygun eldivenler ve göz koruması) kullanın. SDS’yi 75 μL% 20 Triton X-100 ekleyerek ve 1 saat boyunca 37 ° C’de çalkalama ile inkübe ederek söndürün. Numuneden sindirilmemiş bir kontrol olarak 10 μL alın. 4 °C’de saklayın. 400 U DpnII ekleyin ve gece boyunca ajitasyonla 37 ° C’de inkübe edin. 3. Gün 2 NOT: Ortalama olarak, lisans öğrencilerinin bu adımları tamamlamaları 5 saat sürer. Kromatin sindirimiEk bir 200 U DpnII ekleyin ve çapraz bağlı numunenin tamamen sindirilmesini sağlamak için numuneleri 37 ° C’de ajitasyonla 4 saat boyunca inkübe edin. Sindirim kontrolü olarak numunelerden 10 μL’lik bir aliquot alın. Numuneyi 65 ° C’de 20 dakika boyunca inkübe ederek (veya üreticinin talimatlarına göre) kısıtlama enzimini ısıl olarak inaktive edin. Adım 2.1.3’e geçin. Enzim ısı ile inaktive edilemezse, 80 μL% 10 SDS ekleyin ve numuneyi 65 ° C’de 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, 375 μL% 20 Triton X-100 ekleyin ve dönerek karıştırın. Numuneyi 37 ° C’de 1 saat boyunca inkübe edin ve adım 2.2’ye devam edin. Kromatin ligasyonuNumuneyi temiz bir 50 mL konik tüpe aktarın, numune hacmini moleküler sınıfH2O ile 5,7 mL’ye ayarlayın ve dönerek karıştırın. 700 μL 10x T4 Ligaz tamponu ekleyin ve dönerek karıştırın. 60 U T4 DNA Ligaz ekleyin ve dönerek karıştırın. Gece boyunca 16 ° C’de inkübe edin. 4. Gün 3 NOT: Ortalama olarak, lisans öğrencilerinin bu adımları tamamlamaları 15-30 dakika sürer. Gece inkübasyonundan sonra, numuneler dondurulabilir. Protein sindirimi ve ters çapraz bağlama3C numunesine 30 μL proteinaz K (10 mg / mL) ekleyin ve gece boyunca 65 ° C’de çalkalama ile inkübe edin. Sindirilmemiş ve sindirim kontrolüne 5 μL proteinaz K (10 mg / mL) ekleyin ve gece boyunca 65 ° C’de ajitasyonla inkübe edin. 5. Gün 4 NOT: Ortalama olarak, lisans öğrencilerinin bu adımları tamamlamaları 4-5 saat sürer. 3C kütüphanesinin saflaştırılması3C numuneye 30 μL RNaz A (10 mg/mL) ekleyin ve karıştırmak için girdap yapın. Numuneyi 37 ° C’de 45 dakika boyunca inkübe edin. Numuneye 7 mL fenol-kloroform ekleyin ve çalkalayarak karıştırın.DİKKAT: Fenol-kloroform cilt ve göz tahriş edicidir ve temas tedavi edilmezse yanıklara neden olabilir. Fenol-kloroform, uygun göz koruması ve eldivenlere (nitril) sahip bir duman davlumbazında kullanılmalıdır. Numuneyi RT’de 3.270 × g’da 15 dakika boyunca santrifüj edin. sulu fazı toplayın ve temiz bir 50 mL konik tüpe aktarın. Eşit miktarda kloroform ekleyin ve numuneyi çalkalayarak karıştırın. Numuneyi RT’de 3.270 × g’da 15 dakika boyunca santrifüj edin. sulu fazı toplayın ve temiz bir 50 mL konik tüpe aktarın. 7.5 mL moleküler sınıfH2O, 35 mL% 100 etanol ve (isteğe bağlı) 7 μL glikojen (1 mg / mL) ekleyin. Çalkalayarak karıştırın ve numune donana kadar -80 ° C’de inkübe edin.NOT: Numunenin donması 1 saat veya daha fazla sürebilir. Protokol burada duraklatılabilir.3C numunesi donarken, kontrol numunelerini saflaştırın. Kontrol numunelerine, moleküler dereceli su kullanarak ses seviyesini 500 μL’ye ayarlayın ve tüpü hareket ettirerek 2 μL RNase A (10 mg / mL) karışımı ekleyin. Numuneyi tüpün dibinde toplamak için kısaca döndürün. Numuneleri 37 °C’de 45 dakika boyunca inkübe edin. Kontrol numunelerine 1 mL fenol-kloroform ekleyin ve tüpleri çalkalayarak karıştırın. Numuneyi RT’de 3.270 × g’da 15 dakika boyunca santrifüj edin. kontrollerin sulu fazını toplayın ve temiz bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Eşit miktarda kloroform ekleyin ve numuneyi çalkalayarak karıştırın. Numuneyi RT’de 3.270 × g’da 15 dakika boyunca santrifüj edin. kontrollerin sulu fazını toplayın ve temiz bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. 1 mL% 100 etanol ve 2 μL glikojen (1 mg / mL) ekleyin. Çalkalayarak karıştırın ve 30 dakika boyunca -80 ° C’de inkübe edin. Numuneyi 4 °C’de 3.270 × g’da 15 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatanı çıkarın ve 750 μL soğutulmuş% 70 etanol ekleyin. Numuneyi 4 °C’de 3.270 × g’da 10 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatanı çıkarın ve numuneleri havayla kurutun. Peletleri 50 μL moleküler dereceliH2O. Dondurucuda tekrar askıya alın veya adım 6’ya devam edin. Numuneyi 4 °C’de 3.270 × g’da 60 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatanı çıkarın ve 10 mL soğutulmuş% 70 etanol ekleyin. Karıştırmak için numuneyi sallayarak DNA peletini bozun ve parçalayın. Numuneyi 4 °C’de 3.270 × g’da 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve numunenin RT’de kısmen hava ile kurumasına izin verin. pelet yukarı ve aşağı pipetleme yaparak 10 mM Tris-HCl’nin 150 μL’sinde (pH 7.5) tekrar askıya alın. Bu “3C Kütüphanesi”dir.NOT: Numuneyi dondurun veya analize devam edin. 6. Gün 5 NOT: Ortalama olarak, lisans öğrencilerinin bu adımları tamamlamaları 1-2 saat sürer. Kontrol astarının standart eğrisini kullanarak numune kalitesinin belirlenmesiTüm kontrollerin yanı sıra 3C numunesi için DNA konsantrasyonunu ölçün ve numuneleri 30 μg / μL’ye ayarlayın (konsantrasyonlar izin veriyorsa). Seri olarak seyreltilen numuneler dört kez iki kat seyreltilir ve her numune için beş seyreltme ile sonuçlanır (1x, 0.5x, 0.25x, 0.125x, 0.0625x).NOT: Miktar belirleme kolayca yapılamıyorsa, numuneleri yukarıda belirtildiği gibi seri olarak seyreltin ve devam edin. Kontrol primerleri ile seyreltilmiş her numune için 3C, genomik kontrol ve sindirilmiş kontrol için PCR reaksiyonları ayarlayın: 1 μL DNA, 10 μL 5x reaksiyon tamponu, 1 μL 10 mM dNTP, 1 μL 10 mM kontrol primeri (ileri ve geri karışık), 1 μL Taq polimeraz ve 36 μL su. PCR makinesine özgü yazılımın talimatlarını izleyerek, döngü koşullarını kullanarak standart eğri PCR programını aşağıdaki gibi ayarlayın: 98 ° C’de 30 sn; 98 °C’de 5 s, 60 °C’de 5 s ve 72 °C’de 10 s’lik 30 döngü; 72 °C’de 1 dakika; 4 °C tutma. Yazılımı kullanarak, numuneler için standart eğriler oluşturun. Yazılım eğriyi oluşturduktan sonra, PCR verimliliğini ve R2 değerini not alın. DNA konsantrasyonunun belirlenmesi3C örneklerinin DNA konsantrasyonunu belirlemek için, örnekleri bilinen konsantrasyondaki genomik bir DNA örneğiyle karşılaştırın. Numuneleri 30 ng/μL’ye kadar seyreltin ve standart bir eğri oluşturmak için genomik kontrolü 10 ng/μL’den 0,01 ng/μL’ye kadar iki katlı adımlarla seri olarak seyreltin.NOT: Miktar belirleme kolayca yapılamıyorsa, numuneyi 1:10 oranında seyreltin ve devam edin. Kontrol primerleri ile seyreltilmiş her numune için 3C, genomik kontrol ve sindirilmiş kontrol için PCR reaksiyonlarını ayarlayın: 1 μL DNA, 10 μL 5x reaksiyon tamponu, 1 μL 10 mM dNTP, 1 μL 10 mM kontrol primeri (ileri ve geri karışık), 1 μL Taq polimeraz ve 36 μL su. PCR makinesine özgü yazılımın talimatlarını izleyerek, döngü koşullarını kullanarak standart eğri PCR programını aşağıdaki gibi ayarlayın: 98 ° C’de 30 sn; 98 °C’de 5 s, 60 °C’de 5 s ve 72 °C’de 10 s’lik 30 döngü; 72 °C’de 1 dakika; 4 °C tutma. Yazılımı kullanarak, 3C örneklerini eğri üzerinde çizerek numuneler için standart eğriler oluşturun. 3C numune bolluğunun konumunu, bilinen konsantrasyondaki genomik DNA’nın reaksiyonları tarafından oluşturulan standart eğri ile karşılaştırın ve 3C örneklerini 30 ng / μL’ye ayarlayın. Kromatin etkileşiminin varlığının veya yokluğunun belirlenmesi30 ng 3C numunesi, genomik kontrol numunesi ve sindirilmiş kontrol numunesi ile qPCR reaksiyonlarını ayarlayın: 1 μL DNA, 10 μL 5x reaksiyon tamponu, 1 μL 10 mM dNTP, 1 μL 10 mM primer (ileri ve geri karışık), 1 μL Taq polimeraz ve 36 μL su.NOT: Reaksiyonlar, kontrol primeri, bireysel genomik lokuslar için test primerleri ve kromatin etkileşimini belirlemek için kullanılan test primerlerinin istenen kombinasyonları (“a” bölgesi ileri ve “b” ters) kullanılarak ayarlanmalıdır (Şekil 3). PCR makinesinin yazılımı için talimatları izleyerek, PCR programını aşağıdaki gibi ayarlayın: 98 ° C’de 30 sn; 98 °C’de 5 s, 60 °C’de 5 s ve 72 °C’de 10 s’lik 40 döngü; 72 °C’de 1 dakika; 4 °C tutma. PCR çalıştırıldıktan sonra, amplifikasyon grafiğini inceleyin. PCR reaksiyonlarının üstel amplifikasyon gösterdiğinden ve her döngüyü iki katına çıkardığından emin olun.NOT: Üstel amplifikasyon göstermeyen reaksiyonlar daha fazla analiz edilemez. PCR makinesinin yazılımı için talimatları izleyerek, qPCR deneyinin eşiğini tanımlayın. Tüm örnekler için Ct değerlerini dışa aktarın. Denklem (1)’i kullanarak sindirilmemiş kontrol (UC) ve sindirilmiş kontrol (DC) numunelerinden test primeri (TP) ve kontrol primeri (CP) Ct değerlerini kullanarak çürütme verimliliğini belirleyin.Sindirilen yüzde = 100 – (1) Bu değerler% 80 -% 90 sindirim aralığında olmalıdır. Bu değerleri kaydedin (Şekil 4A). Test primer kombinasyonunu (TPC) ve kontrol primeri (CP) Ct değerlerini kullanarak sindirilmemiş kontrol (UC) ve denklem (2) kullanarak 3C (3C) örneklerinden bağıl kromatin etkileşimini belirleyin.Kromatin etkileşimi = 100 – (2) Her numunenin değerlerini, her test primeri kombinasyonu için bir çubuk grafikte çizin. 3C numunesinin kontrol numuneleri üzerinde belirli bir kromatin etkileşiminin zenginleşip zenginleştirilmediğini belirlemek için 3C numunelerinin sinyalini kontrol numuneleriyle karşılaştırın. Kontrol üzerinde zenginleştirme gösteren 3C numuneleri koşullu olarak pozitif olarak kabul edilebilir ve Sanger dizilemesi kullanılarak doğrulama gerektirir (Şekil 4B).NOT: Grafik verilerini analiz ederken, bir “kontrol şablonu” kullanılmadıkça (tartışmaya bakınız), reaksiyonlar arasındaki bolluğun (yani, bir primer kümesinden diğerine) karşılaştırılamayacağını hatırlamak önemlidir. 3C ürünlerinin tanımlanmasıPCR ürünlerini% 1.5’lik bir agaroz jeli üzerinde çalıştırın. Bir UV ışık kutusu veya jel dokümantasyon sistemi kullanarak jeli PCR ürünlerinin doğru boyutu için görselleştirin.NOT: İyi yapılandırılmış 3C kütüphaneleri çok çeşitli DNA fragmanları içerecektir ve primerlerin özgüllük için daha önce doğrulanmasına rağmen, 3C kütüphanelerinden gelen PCR reaksiyonları birçok bant içerme potansiyeline sahiptir (Şekil 5A). Bu, 3C kütüphanelerinin analizini engellemez. Beklenen parça boyutuna karşılık gelen ürün bantlarını tüketim ve ticari bir kitin veya aşağıda özetlenen ev yapımı protokolün talimatlarını izleyerek PCR ürünlerinin jel ekstraksiyonunu gerçekleştirin.DİKKAT: UV ışığı bilinen bir kanserojendir ve UV ışığına maruz kalma süresini sınırlamak için büyük özen gösterilmelidir. UV’ye dayanıklı göz koruması, örnek kalkanı, eldiven ve laboratuvar önlüğü giyilmelidir.Ev yapımı bir arıtma kartuşu oluşturmak için, 0,5 mL’lik bir tüpün dibine bir iğne ile bir delik açın. Bir pamuk topundan az miktarda pamuğu 0,5 mL’lik tüpün dibine koyun ve tüpün yarısından fazlasını doldurmayın. 0,5 mL’lik tüpü 1,5 mL’lik bir tüpe yerleştirin; Küçük tüpün tüpün içinde değil, daha büyük tüpün dudağına dayandığından emin olun. Bir jel parçasını dikkatlice daha küçük parçalara ayırın ve kartuşun 0,5 mL tüpüne yerleştirin. Tertibatı 5 dakika boyunca -20 ° C’lik bir dondurucuya yerleştirin. Montajı RT’de 13.000 × g’da 3 dakika döndürün. Ekstrakte edilen DNA ile 1.5 mL tüpü tamponda tutun ve agaroz kalıntılarını içeren 0.5 mL tüpü atın. Saflaştırılmış DNA, 3C fragmanı için ileri ve geri primerler kullanılarak Sanger dizilimi için gönderilebilir. Blat kullanarak kromatin kontaklarının tanımlanmasıSıralamanın tamamlanmasının ardından, numunelerin sıralama raporunda belirtildiği gibi kalite kontrol standartlarını karşılayıp karşılamadığını belirleyin. QC’yi geçen diziler için, .seq ve .ab1 (trace) dosyalarını Başka Bir Plazmid Düzenleyicisi (ApE) gibi bir sıralama düzenleme programında açın, .ab1 dosyasında net temel çağrı tepe noktaları olup olmadığını inceleyin ve .seq dosyasında yanlış çağrılan tepe noktalarını düzenleyin. Düzenlenen .seq dosyasını kullanarak DpnII sitesini arayın. Dizi sonucuna bağlı olarak, bu rapor edilen dizinin yarısına kadar olmalıdır. Dizinin beklenen hedef dizi olup olmadığını belirlemek için, DpnII bölgesini ve 3C için test edilen genomik lokusların ileri astarına karşılık gelen yukarı akış dizisinin ek 30-50 bp’sini vurgulayın. Hedef türlere karşı bu sekansın Blat aramasını yapın. Genomik lokusların astarınkilerle eşleştiğinden emin olun. Ters primer dizisi için yukarıdaki adımı tekrarlayın, geri dönen genomik lokusun ters primerinkiyle eşleştiğinden emin olun.