Obtendo um A com os 3Cs: Captura de Conformação Cromossômica para Graduandos

1. Projeto do primer NOTA: As ferramentas de projeto de primers 3C estão disponíveis on-line28. Alternativamente, cartilhas personalizadas podem ser projetadas pelos alunos (veja abaixo). Identificação da localização dos primersAbra o UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/), selecione o organismo de estudo e pesquise a região do genoma a ser avaliada usando 3C. Na próxima janela, ative a trilha enzimática na guia Mapeamento e Sequenciamento abaixo do navegador, clicando em Enzimas Restr. Insira a(s) enzima(s) de restrição a ser usada e defina o modo de exibição para embalar. Clique em Enviar. Em Variação e Repetições, verifique se RepeatMasker está definido como denso. Usando os sites de restrição como guias, identifique os locais de interesse que não estão dentro das regiões repetidas mascaradas (barras pretas). Realce 300 pares de bases (bp) flanqueando a sequência a montante e a jusante ao redor do local de restrição, clicando na posição (faixa mais alta) e arrastando para o comprimento desejado (~600 bp). Solte o mouse e uma caixa pop-up aparecerá. Anote a localização genômica, clique em Zoom in e deixe o navegador se reajustar à seleção. Passe o mouse sobre a guia Exibir na faixa de opções superior do navegador e, no menu suspenso, selecione DNA. Deixe a opção padrão, observe a designação de sequências mascaradas (há uma opção para torná-las N’s). Clique em obter DNA. A sequência realçada será exibida na janela. Copie e cole esta sequência em Primer3 (https://primer3.ut.ee/). Usando as configurações padrão Primer3, gere primers clicando em Selecionar primers. Nos resultados, anote a localização da enzima de restrição e selecione primers que criam um produto de PCR de 200-500 pb com o local de restrição localizado no meio. Seguindo essas etapas, projete primers de teste de 1 kilobase (kb), 2 kb, 5 kb, 10 kb e 20 kb do(s) local(is) de interesse. Para projetar os primers de controle de entrada, repita essas etapas para um site de 1 a 2 kB do local de interesse que não tenha um site de restrição, o que significa que ele nunca é cortado. Validação funcional do primerPara validar a funcionalidade do primer, configure reações de PCR usando concentrações tituladas de primers e DNA genômico purificado. Seja por meios quantitativos ou semiquantitativos, determine se os primers criam o produto esperado. Redesenhar primers que falham na validação. 2. Dia 1 NOTA: O protocolo pode ser pausado (congelado a −20 °C) após a reticulação da cromatina e após a coleta de núcleos. As etapas levam, em média, de 5 a 6 h com os alunos de graduação. Coleção de núcleos de C. elegans adulto-jovem (YA) (adaptado de Han et al.29)Reticulação da cromatinaColetar 5.000 vermes YA em 30 mL de meio M9 em um tubo cônico de 50 mL e girar a 400 × g por 2 min à temperatura ambiente (TR). Lave o pellet de minhoca 3x mais com M9 para remover bactérias. Retirar o sobrenadante, ressuspender a pastilha de verme em 47,3 mL de M9 contendo 2,7 mL de formaldeído a 37% (2% final) e incubar com agitação (balanço ou nutação) por 30 min em TR.CUIDADO: Manuseie o formol com cuidado e trabalhe sob uma capa de fumaça com equipamentos de proteção individual adequados (EPI-jaleco, luvas adequadas e proteção ocular). O formaldeído é um irritante que afeta os olhos, nariz, garganta e pulmões. Gire os vermes a 400 × g por 2 min no RT. Retire o sobrenadante e ressuspenda a pastilha de verme em 50 mL de glicina 1 M. Gire os vermes a 400 × g por 2 min no TR. Coleção de núcleosRessuspender o pellet de verme em 6 mL de tampão NP resfriado (50 mM HEPES a pH 7,5, 40 mM NaCl, 90 mM KCl, 2 mM EDTA, 0,5mM EGTA, 0,1% Tween 20, 0,2 mM DTT, 0,5 mM espermidina, 0,25 mM espermina, 1x inibidor completo de protease). Transfira a suspensão de verme para um Dounce solto de 7 mL no gelo. Recupere a amostra 15x e segure no gelo por 5 min. Transfira a suspensão do verme para um Dounce de encaixe apertado de 7 mL no gelo. Recupere a amostra 20x e segure no gelo por 5 min. Transfira a suspensão do worm para um tubo cônico limpo de 15 mL e adicione tampão NP a 10 mL no total (aproximadamente 4 mL). Vórtice a suspensão de vermes em uma configuração alta por 30 s. Incubar a amostra no gelo durante 5 min. Repita a etapa anterior. Gire a suspensão do worm a 100 × g durante 5 min a 4 °C. Transferir o sobrenadante para um novo tubo cônico de 15 mL. Verifique se há detritos de vermes na amostra. Visualize 10 μL da amostra com um microscópio de luz. Se houver restos de vermes, gire a amostra a 2.000 × g por 5 min a 4 °C, ressuspenda o pellet em um novo 10 mL de tampão NP e gire a amostra novamente a 100 × g por 5 min a 4 °C. Descarte o pellet, verifique se há restos de vermes no sobrenadante e repita até que a amostra esteja livre de detritos de vermes.NOTA: Alternativamente, os detritos do verme também podem ser removidos forçando a amostra através de um filtro de células de 40 μm (6x) seguido por um filtro de células de 20 μm (6x). Se a amostra estiver livre de restos de vermes, pegue 5 μL da amostra, adicione 5 μL de pironina verde de metila (os núcleos serão azuis) e conte os núcleos com um hemocitômetro. Girar a amostra a 2.000 × g durante 5 min a 4 °C Retire o sobrenadante, coloque as amostras no gelo e prossiga; alternativamente, congele os núcleos e armazene a -80 °C. Digestão da cromatinaRessuspender os núcleos em 450 μL de água limpa. Transfira os núcleos para um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mL. Para a amostra reticulada, adicione 60 μL de tampão de enzima de restrição 10x DpnII e misture bem.NOTA: Outras enzimas de restrição que ainda cortam o DNA reticulado podem ser usadas. Adicionar 15 μL de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 10% para permeabilizar os núcleos e incubar com agitação (balanço ou nutação) a 37 °C por 1 h.CUIDADO: O SDS é irritante e tóxico se ingerido ou absorvido pela pele. Manuseie com cuidado e use EPIs adequados (jaleco, luvas adequadas e proteção ocular). Extinguir o SDS adicionando 75 μL de Triton X-100 a 20% e incubando com agitação a 37 °C por 1 h. Tomar 10 μL da amostra como um controle não digerido. Conservar a 4 °C. Adicionar 400 U de DpnII e incubar a 37 °C durante a noite com agitação. 3. Dia 2 OBS: Em média, os graduandos levam 5 h para concluir essas etapas. Digestão da cromatinaAdicionar mais 200 U de DpnII e incubar as amostras durante 4 h a 37 °C com agitação para assegurar a digestão completa da amostra reticulada. Tome uma alíquota de 10 μL das amostras como controle da digestão. Inactivar caloricamente a enzima de restrição incubando a amostra durante 20 minutos a 65 °C (ou de acordo com as instruções do fabricante). Continue para a etapa 2.1.3. Se a enzima não puder ser inactivada pelo calor, adicionar 80 μL de SDS a 10% e incubar a amostra durante 30 min a 65 °C. Em seguida, adicione 375 μL de 20% Triton X-100 e misture em rodopio. Incubar a amostra durante 1 h a 37 °C e continuar até ao passo 2.2. Ligadura da cromatinaTransfira a amostra para um tubo cônico limpo de 50 mL, ajuste o volume da amostra para 5,7 mL com H2O de grau molecular e misture em rodopio. Adicionar 700 μL de tampão 10x T4 Ligase e misturar em rodopio. Adicione 60 U de T4 DNA Ligase e misture girando. Incubar durante a noite a 16 °C. 4. Dia 3 NOTA: Em média, os alunos de graduação levam de 15 a 30 minutos para concluir essas etapas. Após a incubação durante a noite, as amostras podem ser congeladas. Digestão de proteínas e reticulação reversaAdicionar 30 μL de proteinase K (10 mg/mL) à amostra 3C e incubar a 65 °C durante a noite com agitação. Adicionar 5 μL de proteinase K (10 mg/mL) ao controle não digerido e da digestão e incubar a 65 °C durante a noite com agitação. 5. Dia 4 NOTA: Em média, os graduandos levam de 4 a 5 h para concluir essas etapas. Purificação da biblioteca 3CAdicionar 30 μL de RNase A (10 mg/mL) à amostra 3C e agitar para misturar. Incubar a amostra durante 45 min a 37 °C. Adicionar 7 ml de fenol-clorofórmio à amostra e misturar agitando.CUIDADO: O fenol-clorofórmio é irritante para a pele e os olhos e pode causar queimaduras se o contato não for tratado. O fenol-clorofórmio deve ser usado em uma capela com proteção ocular adequada e luvas (nitrilo). Centrifugar a amostra por 15 min a 3.270 × g em RT. Coletar a fase aquosa e transferir para um tubo cônico limpo de 50 mL. Adicionar volumes iguais de clorofórmio e misturar a amostra agitando. Centrifugar a amostra por 15 min a 3.270 × g em RT. Coletar a fase aquosa e transferir para um tubo cônico limpo de 50 mL. Adicionar 7,5 mL de H2O de grau molecular, 35 mL de etanol a 100% e (opcional) 7 μL de glicogênio (1 mg/mL). Misturar agitando e incubar a -80 °C até que a amostra esteja congelada.NOTA: Pode levar 1 h ou mais para a amostra congelar. O protocolo pode ser pausado aqui.Enquanto a amostra 3C estiver congelando, purifice as amostras controle. Para as amostras de controle, ajustar o volume para 500 μL usando água de grau molecular e adicionar 2 μL de mistura de RNase A (10 mg/mL) agitando o tubo. Gire brevemente para coletar a amostra no fundo do tubo. Incubar as amostras durante 45 min a 37 °C. Às amostras de controle, adicionar 1 mL de fenol-clorofórmio e misturar agitando os tubos. Centrifugar a amostra por 15 min a 3.270 × g em RT. Coletar a fase aquosa dos controles e colocar em um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mL. Adicionar volumes iguais de clorofórmio e misturar a amostra agitando. Centrifugar a amostra por 15 min a 3.270 × g em RT. Coletar a fase aquosa dos controles e colocar em um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mL. Adicionar 1 mL de etanol a 100% e 2 μL de glicogênio (1 mg/mL). Misture agitando e incube a -80 °C durante 30 minutos. Centrifugar a amostra durante 15 min a 3,270 × g a 4 °C. Retire o sobrenadante e adicione 750 μL de etanol 70% resfriado. Centrifugar a amostra durante 10 min a 3.270 × g a 4 °C. Retire o sobrenadante e seque as amostras ao ar. Ressuspenda o pellet em 50 μL de grau molecular H2O. Congelar, ou continuar até a etapa 6. Centrifugar a amostra durante 60 min a 3.270 × g a 4 °C. Retire o sobrenadante e adicione 10 mL de etanol 70% resfriado. Interrompa e quebre a pelota de DNA agitando a amostra para misturar. Centrifugar a amostra durante 30 min a 3.270 × g a 4 °C. Remova o sobrenadante e deixe a amostra secar parcialmente ao ar em RT. Ressuspenda o pellet em 150 μL de Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) pipetando para cima e para baixo. Esta é a “Biblioteca 3C”.NOTA: Congele a amostra ou continue para a análise. 6. Dia 5 NOTA: Em média, os graduandos levam de 1 a 2 h para concluir essas etapas. Determinação da qualidade da amostra utilizando a curva padrão do primer de controleQuantificar a concentração de ADN para a amostra de 3C, bem como para todos os controlos, e ajustar as amostras para 30 μg/μL (se as concentrações o permitirem). Serially as amostras diluídas duas vezes quatro vezes, resultando em cinco diluições para cada amostra (1x, 0,5x, 0,25x, 0,125x, 0,0625x).NOTA: Se a quantificação não puder ser facilmente feita, dilua em série as amostras conforme indicado acima e prossiga. Estabelecer reações de PCR para o 3C, controle genômico e controle digerido para cada amostra diluída com os primers controle: 1 μL de DNA, 10 μL de tampão de reação 5x, 1 μL de dNTPs 10 mM, 1 μL de primer controle 10 mM (misto direto e reverso), 1 μL de Taq polimerase e 36 μL de água. Seguindo as instruções para o software específico para a máquina de PCR, configure o programa de PCR de curva padrão usando as seguintes condições de ciclagem: 30 s a 98 °C; 30 ciclos de 5 s a 98 °C, 5 s a 60 °C e 10 s a 72 °C; 1 min a 72 °C; 4 °C segurar. Usando o software, gerar as curvas padrão para as amostras. Depois que o software gerar a curva, anote a eficiência do PCR e o valor de R2 . Determinação da concentração de DNAPara determinar a concentração de DNA das amostras 3C, compare as amostras com uma amostra de DNA genômico de concentração conhecida. Diluir as amostras para 30 ng/μL e diluir em série o controle genômico de 10 ng/μL a 0,01 ng/μL em duas etapas para criar uma curva padrão.NOTA: Se a quantificação não puder ser facilmente feita, dilua a amostra 1:10 e prossiga. Estabelecer as reações de PCR para o 3C, controle genômico e controle digerido para cada amostra diluída com os primers controle: 1 μL de DNA, 10 μL de tampão de reação 5x, 1 μL de dNTPs 10 mM, 1 μL de primer controle 10 mM (mistura direta e reversa), 1 μL de Taq polimerase e 36 μL de água. Seguindo as instruções para o software específico para a máquina de PCR, configure o programa de PCR de curva padrão usando as condições de ciclagem da seguinte forma: 30 s a 98 °C; 30 ciclos de 5 s a 98 °C, 5 s a 60 °C e 10 s a 72 °C; 1 min a 72 °C; 4 °C segurar. Usando o software, gere as curvas padrão para as amostras, plotando as amostras 3C na curva. Comparar a posição da abundância da amostra 3C com a curva padrão criada pelas reações do DNA genômico de concentração conhecida, e ajustar as amostras 3C para 30 ng/μL. Determinação da presença ou ausência de interação cromatinaEstabelecer reações de qPCR com 30 ng da amostra 3C, amostra de controle genômico e amostra de controle digerida: 1 μL de DNA, 10 μL de tampão de reação 5x, 1 μL de dNTPs 10 mM, 1 μL de primer 10 mM (mistura direta e reversa), 1 μL de Taq polimerase e 36 μL de água.NOTA: As reacções devem ser configuradas utilizando o primer de controlo, os primers de ensaio para loci genómicos individuais e as combinações desejadas dos primers de ensaio (sítio “a” para a frente e sítio “b” para a reversão) para determinar a interacção da cromatina (Figura 3). Seguindo as instruções para o software da máquina de PCR, configure o programa de PCR da seguinte forma: 30 s a 98 °C; 40 ciclos de 5 s a 98 °C, 5 s a 60 °C e 10 s a 72 °C; 1 min a 72 °C; 4 °C segurar. Após a execução do PCR, inspecione o gráfico de amplificação. Certifique-se de que as reações de PCR apresentem amplificação exponencial, dobrando a cada ciclo.Observação : reações que não exibem amplificação exponencial não podem ser analisadas mais. Seguindo as instruções para o software da máquina de PCR, defina o limiar do experimento de qPCR. Exporte os valores de Ct para todas as amostras. Determinar a eficiência da digestão utilizando os valores de Ct do primer de ensaio (TP) e do primer de controlo (CP) das amostras de controlo não digerido (UC) e de controlo digerido (DC) utilizando a equação (1).Porcentagem digerida = 100 – (1) Esses valores devem estar na faixa de 80% a 90% de digestão. Registre esses valores (Figura 4A). Determinar a interacção relativa da cromatina utilizando os valores de Ct da combinação de primers de ensaio (TPC) e do iniciador de controlo (CP) das amostras de controlo não digerido (UC) e 3C (3C) utilizando a equação (2).Interação cromatina = 100 – (2) Plotar os valores para cada amostra em um gráfico de barras para cada combinação de primers de teste. Comparar o sinal das amostras 3C com as amostras de controlo para determinar se a amostra de 3C tem enriquecimento de uma interacção de cromatina específica sobre as amostras de controlo. Amostras 3C que mostram enriquecimento sobre o controle podem ser consideradas condicionalmente positivas e requerem validação usando o sequenciamento de Sanger (Figura 4B).NOTA: Ao analisar os dados do gráfico, é importante lembrar que, a menos que um “modelo de controle” seja usado (ver discussão), a abundância entre as reações (ou seja, de um conjunto de primers para o próximo) não pode ser comparada. Identificação dos produtos 3CExecute os produtos de PCR em um gel de agarose a 1,5%. Visualize o gel para o tamanho correto dos produtos de PCR usando uma caixa de luz UV ou sistema de documentação de gel.NOTA: Bibliotecas 3C bem construídas conterão uma gama diversificada de fragmentos de DNA e, apesar da validação prévia dos primers para especificidade, as reações de PCR de bibliotecas 3C têm o potencial de conter muitas bandas (Figura 5A). Isso não impede a análise das bibliotecas 3C. Excise as bandas do produto correspondentes ao tamanho esperado do fragmento e realize a extração em gel dos produtos de PCR seguindo as instruções de um kit comercial ou do protocolo caseiro descrito abaixo.CUIDADO: A luz UV é um carcinógeno conhecido, e muito cuidado deve ser tomado para limitar o tempo exposto à luz UV. Proteção ocular resistente aos raios UV, um escudo para espécimes, luvas e um jaleco devem ser usados.Para construir um cartucho de purificação caseiro, faça um furo no fundo de um tubo de 0,5 mL com uma agulha. Embale uma pequena quantidade de algodão de uma bola de algodão no fundo do tubo de 0,5 mL, enchendo não mais do que metade do tubo. Colocar o tubo de 0,5 mL em um tubo de 1,5 mL; Certifique-se de que o tubo menor repousa no lábio do tubo maior, não no tubo. Corte cuidadosamente um fragmento de gel em pedaços menores e coloque-o no tubo de 0,5 mL do cartucho. Coloque o conjunto num congelador de -20 °C durante 5 minutos. Gire o conjunto por 3 min a 13.000 × g em RT. Manter o tubo de 1,5 mL com o DNA extraído em tampão e descartar o tubo de 0,5 mL contendo os detritos de agarose. O DNA purificado pode ser enviado para o sequenciamento de Sanger usando primers forward e reverse para o fragmento 3C. Identificação de contatos de cromatina usando BlatApós a conclusão do sequenciamento, determine se as amostras atendem aos padrões de controle de qualidade indicados no relatório de sequenciamento. Para sequências que passam pelo QC, abra os arquivos .seq e .ab1 (rastreamento) em um programa de edição de sequenciamento, como Outro Editor de Plasmídeos (ApE), inspecione o arquivo .ab1 em busca de picos de chamada de base claros e edite os picos chamados incorretamente no arquivo .seq. Usando o arquivo .seq editado, procure o site DpnII. Dependendo do resultado da sequência, isso deve estar na metade da sequência relatada. Para determinar se a sequência é a sequência alvo esperada, destaque o sítio DpnII e um adicional de 30-50 pb da sequência a montante correspondente ao primer forward dos loci genômicos testados para 3C. Realize uma busca Blat desta sequência contra a espécie-alvo. Certifique-se de que os loci genômicos correspondam aos do primer. Repita a etapa acima para a sequência de primers reversos, certificando-se de que o locus genômico retornado corresponda ao do primer reverso.