3CでAを取得する:学部生のための染色体コンフォメーションキャプチャ

1. プライマー設計 注:3Cプライマー設計ツールはオンラインで入手できます28。あるいは、カスタムプライマーを学生が設計することもできます(以下を参照)。 プライマー位置の同定UCSCゲノムブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)を開き、研究対象生物を選択し、3Cを使用して評価するゲノムの領域を検索します。 次のウィンドウで、ブラウザの下の マッピングとシーケンシング タブで、 Restr Enzymesをクリックして酵素トラックをアクティブにします。 使用する 制限酵素 を入力し、 表示モード を パックに設定します。[ 送信]をクリックします。 バリエーションとリピートで、リピートマスカーが高密度に設定されていることを確認します。 規制サイトをガイドとして使用して、マスクされたリピート領域(黒いバー)内にない関心のあるサイトを特定します。制限部位を囲む上流と下流の両方の配列に隣接する300塩基対(bp)をハイライトするには、 位置(一番上のトラック )をクリックし、目的の長さ(~600 bp)までドラッグします。 マウスを離すと、ポップアップボックスが表示されます。ゲノムの場所をメモし、[ ズームイン]をクリックして、ブラウザを選択範囲に再調整します。 ブラウザーの上部リボンの [ 表示 ] タブの上にマウスを移動し、ドロップダウン メニューで [ DNA] を選択します。 デフォルトのオプションのままにして、マスクされたシーケンスの指定に注意してください(それらを Nにするオプションがあります)。 [DNAを取得]をクリックします。 強調表示されたシーケンスがウィンドウに表示されます。この配列をコピーして Primer3 (https://primer3.ut.ee/) に貼り付けます。 Primer3のデフォルト設定を使用して、プライマー の選択をクリックしてプライマーを生成します。 結果では、制限酵素の位置をメモし、制限部位が中央に位置する200〜500 bp PCR産物を作成するプライマーを選択します。 これらのステップに続いて、目的の部位から1キロ塩基(kb)、2 kb、5 kb、10 kb、および20 kbの試験プライマーを設計します。 入力コントロールプライマーを設計するには、制限部位を欠く、つまり切断されない、関心のある部位から1〜2 kBの部位に対してこれらの手順を繰り返します。 機能的プライマーバリデーションプライマーの機能を検証するには、滴定されたプライマー濃度と精製されたゲノムDNAを使用してPCR反応を設定します。定量的または半定量的手段のいずれかを使用して、プライマーが期待される生成物を作成するかどうかを判断します。 バリデーションに失敗したプライマーを再設計します。 2. 1日目 注:プロトコルは、クロマチン架橋後および核採取後に一時停止(-20°Cで凍結)することができます。ステップは、平均して、学部生で5-6時間かかります。 ヤングアダルト(YA) C.エレガンス 核コレクション(Hanら29から適応)クロマチン架橋50 mLコニカルチューブ内の30 mLのM9培地に5,000 YAワームを採取し、室温(RT)で400 × g で2分間回転させます。 ワームペレットをM3でさらに9倍洗浄して、バクテリアを取り除きます。 上清を除去し、ワームペレットを2.7 mLの37%ホルムアルデヒド(2%最終)を含む47.3 mLのM9に再懸濁し、RTで30分間攪拌(ロッキングまたはナット)しながらインキュベートします。注意: ホルムアルデヒドの取り扱いには注意し、適切な個人用保護具(PPEラボコート、適切な手袋、および目の保護具)を使用してドラフトの下で作業してください。ホルムアルデヒドは、目、鼻、喉、肺に影響を与える刺激物です。 ワームを400 × g でRTで2分間回転させます。 上清を除去し、ワームペレットを50 mLの1 Mグリシンに再懸濁します。ワームを400 × g でRTで2分間回転させます。 核コレクションワームペレットを6 mLのチルドNPバッファー(pH 7.5の50 mM HEPES、40 mM NaCl、90 mM KCl、2 mM EDTA、0.5mM EGTA、0.1% Tween 20、0.2 mM DTT、0.5 mM スペルミジン、0.25 mM スペルミン、1x完全プロテアーゼ阻害剤)に再懸濁します。 ワーム懸濁液を7 mLのゆったりとした氷の上のダウンスに移します。サンプルを15倍に浸し、氷上で5分間保持します。 ワーム懸濁液を7 mLのぴったりとフィットする氷上のダウンスに移します。サンプルを20倍に浸し、氷上で5分間保持します。 ワーム懸濁液を清潔な15 mLコニカルチューブに移し、NPバッファーを合計10 mL(約4 mL)に加えます。 ワームサスペンションを30秒間高い設定でボルテックスします。サンプルを氷上で5分間インキュベートします。 前の手順を繰り返します。 ワーム懸濁液を100 × g で4°Cで5分間回転させます。 上清を新しい15 mLコニカルチューブに移します。 サンプルにワームの破片がないか確認します。10 μLのサンプルを光学顕微鏡で可視化します。ワームの破片が存在する場合は、サンプルを2,000 × g で4°Cで5分間回転させ、ペレットを新しい10 mLのNPバッファーに再懸濁し、サンプルを100 × g で4°Cで5分間再度回転させます。 ペレットを廃棄し、上清にワームの破片がないか確認し、サンプルにワームの破片がなくなるまで繰り返します。注:あるいは、40 μmのセルストレーナー(6x)に続いて20 μmのセルストレーナー(6x)を通してサンプルに濾すことによって、ワームの破片を除去することもできます。 サンプルにワームの破片がない場合は、5 μLのサンプルを採取し、5 μLのメチルグリーンピロニン(核は青色になります)を追加し、血球計算盤で核を数えます。 サンプルを2,000 × g で4°Cで5分間回転させます 上清を取り除き、サンプルを氷の上に置き、続行します。あるいは、核を急速凍結し、-80°Cで保存します。 クロマチン消化核を450 μLのきれいな水に再懸濁します。核を清潔な1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。 架橋サンプルに60 μLの10x DpnII制限酵素バッファーを加え、よく混ぜます。注:架橋DNAを切断する他の制限酵素を使用することができる。 15 μLの10%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を加えて核を透過処理し、攪拌(ロッキングまたはナット)しながら37°Cで1時間インキュベートします。注意: SDSは刺激性であり、皮膚から摂取または吸収されると有毒です。取り扱いには注意し、適切なPPE(白衣、適切な手袋、目の保護具)を使用してください。 75 μLの20%Triton X-100を添加し、37°Cで1時間撹拌してSDSをクエンチします。 未消化コントロールとしてサンプルから10 μLを採取します。4°Cで保存してください。 400 U の DpnII を添加し、撹拌しながら 37 °C で一晩インキュベートします。 3. 2日目 注:平均して、学部生はこれらの手順を完了するのに5時間かかります。 クロマチン消化さらに200 UのDpnIIを添加し、サンプルを攪拌しながら37°Cで4時間インキュベートして、架橋サンプルの完全な分解を確実にします。 消化コントロールとしてサンプルから10 μLのアリコートを採取します。 サンプルを65°Cで20分間インキュベートすることにより(または製造元の指示に従って)制限酵素を熱失活します。手順 2.1.3 に進みます。 酵素が熱で失活できない場合は、80 μLの10% SDSを添加し、サンプルを65°Cで30分間インキュベートします。 次に、375 μLの20%トリトンX-100を加え、旋回させて混合します。サンプルを37°Cで1時間インキュベートし、ステップ2.2に進みます。 クロマチンライゲーションサンプルを清潔な50 mLコニカルチューブに移し、サンプル量を分子グレードのH2Oで5.7 mLに調整し、旋回させて混合します。 700 μLの10x T4リガーゼバッファーを加え、スワーリングして混合します。 60 UのT4 DNAリガーゼを加え、渦巻きながら混合します。 16°Cで一晩インキュベートします。 4. 3日目 注:平均して、学部生がこれらの手順を完了するのに15〜30分かかります。一晩インキュベーションした後、サンプルを凍結することができます。 タンパク質消化と逆架橋3Cサンプルに30 μLのプロテイナーゼK(10 mg/mL)を加え、撹拌しながら65°Cで一晩インキュベートします。5 μLのプロテイナーゼK(10 mg/mL)を未消化および消化コントロールに加え、撹拌しながら65°Cで一晩インキュベートします。 5. 4日目 注:平均して、学部生がこれらの手順を完了するのに4〜5時間かかります。 3Cライブラリの精製3Cサンプルに30 μLのRNase A(10 mg/mL)を加え、旋回させて混合します。サンプルを37°Cで45分間インキュベートします。 サンプルにフェノール-クロロホルム7 mLを加え、振とうして混合します。注意: フェノール-クロロホルムは皮膚や目の刺激性であり、接触を治療しないと火傷を引き起こす可能性があります。フェノール-クロロホルムは、適切な目の保護具と手袋(ニトリル)を備えたドラフトで使用する必要があります。 サンプルをRTで3,270 × g で15分間遠心分離します。 水相を回収し、清潔な50 mLコニカルチューブに移します。等量のクロロホルムを加え、振とうしてサンプルを混合します。 サンプルをRTで3,270 × g で15分間遠心分離します。 水相を回収し、清潔な50 mLコニカルチューブに移します。7.5 mLの分子グレードH2O、35 mLの100%エタノール、および(オプションで)7 μLのグリコーゲン(1 mg / mL)を追加します。振とうして混合し、サンプルが凍結するまで-80°Cでインキュベートします。注意: サンプルが凍結するまでに1時間以上かかる場合があります。プロトコルはここで一時停止できます。3Cサンプルが凍結している間に、コントロールサンプルを精製します。コントロールサンプルに、分子グレードの水を使用して容量を500 μLに調整し、チューブをフリックして2 μLのRNase A(10 mg / mL)ミックスを追加します。 チューブの底でサンプルを収集するために短時間回転します。サンプルを37°Cで45分間インキュベートします。 対照試料に、フェノール-クロロホルム1mLを加え、チューブを振って混合する。サンプルをRTで3,270 × g で15分間遠心分離します。 コントロールの水相を収集し、清潔な1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れます。 等量のクロロホルムを加え、振とうしてサンプルを混合します。サンプルをRTで3,270 × g で15分間遠心分離します。 コントロールの水相を採取し、清潔な1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れます。 1 mLの100%エタノールと2 μLのグリコーゲン(1 mg / mL)を追加します。振とうして混合し、-80°Cで30分間インキュベートします。 サンプルを4°Cで3,270 × g で15分間遠心分離します。 上清を取り除き、冷やした70%エタノール750μLを加える。 サンプルを4°Cで3,270 × g で10分間遠心分離します。 上清を除去し、サンプルを風乾します。ペレットを50 μLの分子グレードH2Oに再懸濁します。 凍結するか、ステップ6に進みます。 サンプルを4°Cで3,270 × g で60分間遠心分離します。 上清を取り除き、冷やした70%エタノール10mLを加える。サンプルを振って混合することにより、DNAペレットを破壊して破壊します。 サンプルを3,270 × g 、4°Cで30分間遠心分離します。 上清を取り除き、サンプルをRTで部分的に風乾させます。 上下にピペッティングして、ペレットを150 μLの10 mM Tris-HCl(pH 7.5)に再懸濁します。これが「3Cライブラリ」です。注:サンプルを凍結するか、分析を続行します。 6. 5日目 注:平均して、学部生がこれらの手順を完了するのに1〜2時間かかります。 コントロールプライマーの検量線を用いたサンプル品質の決定3CサンプルとすべてのコントロールのDNA濃度を定量し、サンプルを30 μg/μLに調整します(濃度が許せば)。サンプルを2倍に4倍に希釈し、各サンプルに対して5回希釈します(1x、0.5x、0.25x、0.125x、0.0625x)。注:定量が簡単にできない場合は、上記のようにサンプルを段階的に希釈して続行します。 コントロールプライマーを使用して、希釈サンプルごとに3C、ゲノムコントロール、および消化コントロールのPCR反応を設定します:1 μLのDNA、10 μLの5x反応バッファー、1 μLの10 mM dNTP、1 μLの10 mMコントロールプライマー(順方向および逆方向の混合)、1 μLのTaqポリメラーゼ、および36 μLの水。 PCRマシンに固有のソフトウェアの指示に従って、次のようにサイクリング条件を使用して標準曲線PCRプログラムをセットアップします:98°Cで30秒。98°Cで5秒、60°Cで5秒、72°Cで10秒の30サイクル。72°Cで1分間;4°Cホールド。 ソフトウェアを使用して、サンプルの標準曲線を生成します。ソフトウェアが曲線を生成した後、PCR効率とR2 値に注意してください。 DNA濃度の決定3CサンプルのDNA濃度を決定するには、サンプルを既知の濃度のゲノムDNAサンプルと比較します。サンプルを30 ng/μLに希釈し、ゲノムコントロールを10 ng/μLから0.01 ng/μLまで2段階で段階的に希釈して、検量線を作成します。注:定量が簡単にできない場合は、サンプルを1:10に希釈して続行します。 コントロールプライマーを使用して、希釈サンプルごとに3C、ゲノムコントロール、および消化コントロールのPCR反応を設定します:1 μLのDNA、10 μLの5x反応バッファー、1 μLの10 mM dNTP、1 μLの10 mMコントロールプライマー(順方向および逆方向混合)、1 μLのTaqポリメラーゼ、および36 μLの水。 PCRマシン専用のソフトウェアの指示に従って、次のようにサイクリング条件を使用して標準曲線PCRプログラムをセットアップします:98°Cで30秒。98°Cで5秒、60°Cで5秒、72°Cで10秒の30サイクル。72°Cで1分間;4°Cホールド。 ソフトウェアを使用して、サンプルの標準曲線を生成し、3Cサンプルを曲線上にプロットします。3Cサンプルの存在量の位置を、既知の濃度のゲノムDNAの反応によって作成された標準曲線と比較し、3Cサンプルを30 ng / μLに調整します。 クロマチン相互作用の有無の判定30 ng の 3C サンプル、ゲノムコントロールサンプル、および消化コントロールサンプル (1 μL の DNA、10 μL の 5x 反応バッファー、1 μL の 10 mM dNTP、1 μL の 10 mM プライマー (順方向および逆方向混合)、1 μL の Taq ポリメラーゼ、および 36 μL の水) を使用して qPCR 反応を設定します。注:反応は、コントロールプライマー、個々のゲノム遺伝子座のテストプライマー、およびクロマチン相互作用を決定するために使用されるテストプライマーの所望の組み合わせ(サイト「a」フォワードとサイト「b」リバース)を使用して設定する必要があります(図3)。 PCRマシンのソフトウェアの指示に従って、PCRプログラムを次のようにセットアップします:98°Cで30秒。98°Cで5秒、60°Cで5秒、72°Cで10秒の40サイクル。72°Cで1分間;4°Cホールド。 PCRを実行した後、増幅プロットを調べます。PCR反応が指数関数的な増幅を示し、サイクルごとに2倍になるようにします。注:指数増幅を示さない反応は、それ以上分析することはできません。 PCRマシンのソフトウェアの指示に従って、qPCR実験の閾値を定義します。 すべてのサンプルのCt値をエクスポートします。 式(1)を用いて、未消化コントロール(UC)および消化コントロール(DC)サンプルからのテストプライマー(TP)およびコントロールプライマー(CP)Ct値を用いて消化効率を決定する。消化率 = 100 – (1) これらの値は80%-90%消化の範囲にあるべきです。これらの値を記録します(図4A)。 式(2)を使用して、テストプライマーの組み合わせ(TPC)とコントロールプライマー(CP)を使用して、未消化コントロール(UC)および3C(3C)サンプルからのCt値を使用して、相対的なクロマチン相互作用を決定します。クロマチン相互作用 = 100 – (2) 各サンプルの値を、各テストプライマーの組み合わせの棒グラフにプロットします。 3Cサンプルのシグナルをコントロールサンプルと比較して、3Cサンプルがコントロールサンプル上で特定のクロマチン相互作用を豊富に含んでいるかどうかを判断します。コントロール上で濃縮を示す3Cサンプルは、条件付きで陽性と見なすことができ、サンガーシーケンシングを使用した検証が必要です(図4B)。注:グラフデータを分析する際には、「コントロールテンプレート」を使用しない限り(議論を参照)、反応間の存在量(すなわち、あるプライマーセットから次のプライマーセットへ)を比較することはできないことを覚えておくことが重要です。 3C製品の識別PCR産物を1.5%アガロースゲル上で分析します。 UVライトボックスまたはゲルドキュメンテーションシステムを使用して、PCR産物の正しいサイズのゲルを視覚化します。注:適切に構築された3Cライブラリには多様なDNA断片が含まれており、プライマーの特異性に関する以前の検証にもかかわらず、3CライブラリからのPCR反応には多くのバンドが含まれる可能性があります(図5A)。これは、3Cライブラリの分析を妨げるものではありません。 予想されるフラグメントサイズに対応する産物バンドを切除し、市販キットまたは以下に概説する自家製のプロトコルの指示に従ってPCR産物のゲル抽出を実行します。注意: UV光は既知の発がん性物質であり、UV光にさらされる時間を制限するように細心の注意を払う必要があります。耐紫外線性の目の保護具、標本シールド、手袋、および白衣を着用する必要があります。自家製の精製カートリッジを構築するには、0.5 mLチューブの底に針で穴を開けます。 コットンボールから0.5 mLチューブの底に少量の綿を詰め、チューブの半分以下を満たします。 0.5 mLチューブを1.5 mLチューブに入れます。小さい方のチューブが、チューブ内ではなく、大きい方のチューブのリップにあることを確認してください。 ゲル片を慎重に細かく切り、カートリッジの0.5 mLチューブに入れます。 アセンブリを-20°Cの冷凍庫に5分間入れます。アセンブリをRTで13,000 × g で3分間回転させます。 抽出したDNAを入れた1.5 mLチューブをバッファーに保持し、アガロース破片を含む0.5 mLチューブを廃棄します。 精製されたDNAは、3Cフラグメントのフォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用してサンガーシーケンシングに送ることができます。 Blatを用いたクロマチン接触の同定シーケンシングが完了したら、サンプルがシーケンシングレポートに示されている品質管理基準を満たしているかどうかを判断します。 QC に合格した配列の場合は、別のプラスミドエディター (ApE) などのシーケンシング編集プログラムで .seq ファイルと .ab1 (trace) ファイルを開き、.ab1 ファイルで明確なベース呼び出しピークがないか調べ、.seq ファイルで誤って呼び出されたピークを編集します。 編集した .seq ファイルを使用して、DpnII サイトを検索します。シーケンスの結果によっては、これは報告されたシーケンスの途中にあるはずです。 配列が予想される標的配列であるかどうかを判断するには、DpnII部位と、3Cについて試験したゲノム遺伝子座のフォワードプライマーに対応する上流配列の追加の30〜50 bpを強調表示します。この配列のBlat検索を標的種に対して実行します。ゲノム遺伝子座がプライマーの遺伝子座と一致していることを確認してください。 リバースプライマー配列に対して上記の手順を繰り返し、戻ってきたゲノム遺伝子座がリバースプライマーの遺伝子座と一致することを確認します。