Aislamiento de vesículas extracelulares de bajo contenido de endotoxinas derivadas de líneas celulares cancerosas

Las vesículas extracelulares (EV), según la nomenclatura MISEV 2018, son un término colectivo que describe varios subtipos de vesículas membranosas secretadas por células que desempeñan un papel crucial en numerosos procesos fisiológicos y patológicos ^1,2. Además, los vehículos eléctricos son prometedores como nuevos biomarcadores para diversas enfermedades, así como como agentes terapéuticos y vehículos de administración de fármacos. Sin embargo, realizar todo su potencial es difícil, ya que todavía hay muchos obstáculos técnicos relacionados con su adquisición³. Uno de esos desafíos es el aislamiento de EV libres de endotoxinas, que se ha descuidado en muchos casos. Una de las endotoxinas más comunes es el lipopolisacárido (LPS), que es un componente importante de las paredes celulares bacterianas gramnegativas y puede causar una respuesta inflamatoria aguda, debido a la liberación de un gran número de citoquinas inflamatorias por varias células ^4,5. LPS induce una respuesta mediante la unión a la proteína de unión a LPS, seguida de la interacción con el complejo CD14/TLR4/MD2 en las células mieloides. Esta interacción conduce a la activación de vías de señalización dependientes de MyD88 y TRIF, que a su vez desencadenan el factor nuclear kappa B (NFkB). La translocación de NFkB al núcleo inicia la producción de citoquinas⁶. Los monocitos y macrófagos son altamente sensibles al LPS, y su exposición al LPS resulta en una liberación de citoquinas inflamatorias y quimiocinas (por ejemplo, IL-6, IL-12, CXCL8 y TNF-α)^7,8. La estructura CD14 permite la unión de diferentes especies de LPS con afinidad similar y sirve como co-receptor para otros receptores tipo toll (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 y 9)⁶. El número de estudios que se están realizando sobre los efectos de las EV en monocitos/macrófagos sigue aumentando 9,10,11. Especialmente desde la perspectiva del estudio de las funciones de los monocitos, sus subpoblaciones y otras células inmunes, la presencia de endotoxinas e incluso su presencia enmascarada en EV es de gran importancia¹². La contaminación pasada por alto de los vehículos eléctricos con endotoxinas puede llevar a conclusiones engañosas y ocultar su verdadera actividad biológica. En otras palabras, trabajar con células monocíticas requiere confianza en ausencia de contaminación por endotoxinas¹³. Las fuentes potenciales de endotoxinas pueden ser agua, medios y sueros obtenidos comercialmente, componentes y aditivos de medios, cristalería de laboratorio y artículos de plástico 5,14,15.

Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo desarrollar un protocolo para el aislamiento de EV con bajo contenido de endotoxinas. El protocolo proporciona consejos simples sobre cómo evitar la contaminación por endotoxinas durante el aislamiento de EV en lugar de eliminar las endotoxinas de EV. Anteriormente, se han presentado muchos protocolos sobre cómo eliminar endotoxinas de, por ejemplo, nanopartículas diseñadas utilizadas en nanomedicina; sin embargo, ninguno de ellos es útil para estructuras biológicas como los EV. La despirogenación efectiva de nanopartículas puede llevarse a cabo mediante enjuague con etanol o ácido acético, calentamiento a 175 °C durante 3 h, irradiación γ o tratamiento con tritón X-100; sin embargo, estos procedimientos conducen a la destrucción de los vehículos eléctricos^16,17.

El protocolo presentado es un estudio pionero centrado en evitar las impurezas de endotoxinas en las EV, a diferencia de estudios previos sobre el efecto de las EV en los monocitos⁹. La aplicación de los principios propuestos a la práctica de laboratorio puede ayudar a obtener resultados de investigación confiables, lo que puede ser crucial cuando se considera el uso potencial de EV como agentes terapéuticos en la clínica¹².