がん細胞株由来の低エンドトキシン含量細胞外小胞の単離

MISEV 2018命名法によると、細胞外小胞(EV)は、多くの生理学的および病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす細胞分泌膜小胞のさまざまなサブタイプを表す総称です^1,2。さらに、EVは、さまざまな疾患の新規バイオマーカー、治療薬、ドラッグデリバリービークルとして有望視されています。しかし、買収に関連する多くの技術的障害がまだあるため、それらの可能性を最大限に引き出すことは困難です³。そのような課題の1つは、多くの場合無視されてきたエンドトキシンフリーEVの分離です。最も一般的なエンドトキシンの1つはリポ多糖(LPS)であり、これはグラム陰性細菌細胞壁の主成分であり、さまざまな細胞による多数の炎症性サイトカインの放出により急性炎症反応を引き起こす可能性があります^4,5。LPSは、LPS結合タンパク質に結合し、続いて骨髄系細胞上のCD14/TLR4/MD2複合体との相互作用によって応答を誘導します。この相互作用は、MyD88およびTRIF依存性シグナル伝達経路の活性化をもたらし、それが次に核因子κB(NFkB)を誘発する。NFkBの核への転座は、サイトカイン⁶の産生を開始する。単球およびマクロファージはLPSに対して非常に感受性が高く、LPSへの曝露は炎症性サイトカインおよびケモカイン(例えば、IL-6、IL-12、CXCL8、およびTNF-α)の放出をもたらす^7,8。CD14構造は、同様の親和性を持つ異なるLPS種の結合を可能にし、他のトール様受容体(TLR)(TLR1、2、3、4、6、7、および^9)の共受容体として機能します6。単球/マクロファージに対するEVの効果について実施されている研究の数は、依然として増加しています9,10,11。特に単球、その亜集団、および他の免疫細胞の機能を研究する観点から、エンドトキシンの存在、さらにはEVにおけるそれらのマスクされた存在さえも非常に重要です¹²。エンドトキシンによるEVの見過ごされた汚染は、誤解を招く結論につながり、それらの真の生物学的活性を隠す可能性があります。言い換えれば、単球細胞を扱うには、エンドトキシン汚染がないことに自信が必要です¹³。エンドトキシンの潜在的な供給源は、水、商業的に入手した培地および血清、培地成分および添加剤、実験用ガラス器具、およびプラスチック製品であり得る⁵、^14、15。

したがって、この研究は、低エンドトキシン含有EVの分離のためのプロトコルを開発することを目的としていました。このプロトコルは、EVからエンドトキシンを除去する代わりに、EVの分離中にエンドトキシン汚染を回避する方法に関する簡単なヒントを提供します。これまで、ナノメディシンで使用される操作されたナノ粒子などからエンドトキシンを除去する方法について多くのプロトコルが提示されてきました。しかし、それらのどれもEVのような生物学的構造には有用ではありません。ナノ粒子の効果的な脱パイロジェン化は、エタノールまたは酢酸のすすぎ、175°Cでの3時間の加熱、γ照射、またはトリトンX-100処理によって行うことができます。ただし、これらの手順は^EV16,17の破壊につながります。

提示されたプロトコルは、単球に対するEVの影響に関する以前の研究とは異なり、EV中のエンドトキシン不純物の回避に焦点を当てた先駆的な研究^です9。 提案された原則を実験室診療に適用することは、信頼できる研究結果を得るのに役立つ可能性があり、これは、診療所での治療薬としてのEVの潜在的な使用を検討する際に重要になる可能性があります¹²。