عزل الحويصلات خارج الخلية ذات المحتوى المنخفض من السموم الداخلية المشتقة من خطوط الخلايا السرطانية
Summary
يتضمن البروتوكول المقترح إرشادات حول كيفية تجنب التلوث بالذيفان الداخلي أثناء عزل الحويصلات خارج الخلية من طافات زراعة الخلايا ، وكيفية تقييمها بشكل صحيح.
Abstract
الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي مجموعة غير متجانسة من الحويصلات الغشائية التي تطلقها الخلايا في المختبر وفي الجسم الحي. إن وجودها في كل مكان ودورها الهام كحاملين للمعلومات البيولوجية يجعلها كائنات دراسة مثيرة للاهتمام ، وتتطلب بروتوكولات موثوقة ومتكررة لعزلها. ومع ذلك ، فإن تحقيق إمكاناتهم الكاملة أمر صعب حيث لا تزال هناك العديد من العقبات التقنية المتعلقة بأبحاثهم (مثل الاستحواذ المناسب). تقدم هذه الدراسة بروتوكولا لعزل المركبات الكهربائية الصغيرة (وفقا لتسمية MISEV 2018) من طاف الثقافة لخطوط الخلايا السرطانية على أساس الطرد المركزي التفاضلي. يتضمن البروتوكول إرشادات حول كيفية تجنب التلوث بالسموم الداخلية أثناء عزل المركبات الكهربائية وكيفية تقييمها بشكل صحيح. يمكن أن يؤدي تلوث السموم الداخلية للمركبات الكهربائية إلى إعاقة التجارب اللاحقة بشكل كبير أو حتى إخفاء آثارها البيولوجية الحقيقية. من ناحية أخرى ، قد يؤدي التغاضي عن وجود السموم الداخلية إلى استنتاجات غير صحيحة. هذا له أهمية خاصة عند الإشارة إلى خلايا الجهاز المناعي ، بما في ذلك الخلايا الوحيدة ، لأن الوحيدات تشكل مجموعة حساسة بشكل خاص لبقايا السموم الداخلية. لذلك ، يوصى بشدة بفحص EVs بحثا عن تلوث السموم الداخلية ، خاصة عند العمل مع الخلايا الحساسة للسموم الداخلية مثل الخلايا الوحيدة أو الضامة أو الخلايا المثبطة المشتقة من النخاع أو الخلايا المتغصنة.
Introduction
الحويصلات خارج الخلية (EVs) ، وفقا لتسمية MISEV 2018 ، هي مصطلح جماعي يصف أنواعا فرعية مختلفة من الحويصلات الغشائية التي تفرزها الخلايا والتي تلعب أدوارا حاسمة في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية 1,2. علاوة على ذلك ، تظهر المركبات الكهربائية واعدة كمؤشرات حيوية جديدة لمختلف الأمراض ، بالإضافة إلى العوامل العلاجية ووسائل توصيل الأدوية. ومع ذلك ، فإن تحقيق إمكاناتها الكاملة أمر صعب حيث لا تزال هناك العديد من العقبات الفنية المتعلقة بالاستحواذ عليها3. أحد هذه التحديات هو عزل المركبات الكهربائية الخالية من السموم الداخلية ، والتي تم إهمالها في كثير من الحالات. واحدة من السموم الداخلية الأكثر شيوعا هي عديد السكاريد الدهني (LPS) ، وهو مكون رئيسي لجدران الخلايا البكتيرية سالبة الجرام ويمكن أن يسبب استجابة التهابية حادة ، بسبب إطلاق عدد كبير من السيتوكينات الالتهابية بواسطة خلايا مختلفة 4,5. يحفز LPS استجابة عن طريق الارتباط ببروتين ربط LPS ، يليه التفاعل مع مركب CD14 / TLR4 / MD2 على الخلايا النخاعية. يؤدي هذا التفاعل إلى تنشيط مسارات الإشارات المعتمدة على MyD88 و TRIF ، والتي بدورها تؤدي إلى العامل النووي kappa B (NFkB). يؤدي نقل NFkB إلى النواة إلى بدء إنتاج السيتوكينات6. تعتبر الخلايا الوحيدة والبلاعم شديدة الحساسية ل LPS ، ويؤدي تعرضها ل LPS إلى إطلاق السيتوكينات الالتهابية والكيموكينات (على سبيل المثال ، IL-6 و IL-12 و CXCL8 و TNF-α)7,8. يتيح هيكل CD14 ربط أنواع LPS المختلفة ذات التقارب المماثل ويعمل كمستقبل مشارك للمستقبلات الأخرى الشبيهة بالحصيلة (TLR1 و 2 و 3 و 4 و 6 و 7 و 9) 6. لا يزال عدد الدراسات التي أجريت حول تأثيرات المركبات الكهربائية على الخلايا الوحيدة / الضامة يتزايد9،10،11. خاصة من منظور دراسة وظائف الخلايا الوحيدة ، ومجموعاتها الفرعية ، والخلايا المناعية الأخرى ، فإن وجود السموم الداخلية وحتى وجودها المقنع في المركبات الكهربائية له أهمية كبيرة12. قد يؤدي التلوث الذي يتم التغاضي عنه للمركبات الكهربائية بالسموم الداخلية إلى استنتاجات مضللة وإخفاء نشاطها البيولوجي الحقيقي. وبعبارة أخرى ، فإن العمل مع الخلايا الوحيدة يتطلب الثقة في غياب تلوث السموم الداخلية13. يمكن أن تكون المصادر المحتملة للسموم الداخلية هي الماء ، والوسائط والأمصال التي تم الحصول عليها تجاريا ، ومكونات الوسائط والمواد المضافة ، والأواني الزجاجية المختبرية ، والأواني البلاستيكية5،14،15.
لذلك ، تهدف هذه الدراسة إلى تطوير بروتوكول لعزل المركبات الكهربائية منخفضة السموم الداخلية. يوفر البروتوكول تلميحات بسيطة حول كيفية تجنب تلوث السموم الداخلية أثناء عزل المركبات الكهربائية بدلا من إزالة السموم الداخلية من المركبات الكهربائية. في السابق ، تم تقديم العديد من البروتوكولات حول كيفية إزالة السموم الداخلية من ، على سبيل المثال ، الجسيمات النانوية المهندسة المستخدمة في الطب النانوي. ومع ذلك ، لا يوجد أي منها مفيد للهياكل البيولوجية مثل المركبات الكهربائية. يمكن إجراء إزالة الحرارة الفعالة للجسيمات النانوية عن طريق شطف الإيثانول أو حمض الخليك ، أو التسخين عند 175 درجة مئوية لمدة 3 ساعات ، أو تشعيع γ ، أو معالجة Triton X-100 ؛ ومع ذلك ، فإن هذه الإجراءات تؤدي إلى تدمير المركبات الكهربائية16,17.
البروتوكول المقدم هو دراسة رائدة تركز على تجنب شوائب السموم الداخلية في المركبات الكهربائية ، على عكس الدراسات السابقة حول تأثير EVs على الخلايا الوحيدة9. قد يساعد تطبيق المبادئ المقترحة على الممارسة المختبرية في الحصول على نتائج بحثية موثوقة ، والتي يمكن أن تكون حاسمة عند النظر في الاستخدام المحتمل للمركبات الكهربائية كعوامل علاجية فيالعيادة 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
في السنوات القليلة الماضية ، أصبحت طرق عزل المركبات الكهربائية المناسبة ذات أهمية متزايدة ، مما يتيح إجراء مزيد من التحليلات الموثوقة ، على سبيل المثال ، في سياق الحصول على بيانات أوميكس وبيانات وظيفية موثوقة24. بناء على الخبرة البحثية السابقة ، يبدو أنه ليس فقط نوع طريقة الع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المركز الوطني للعلوم ، بولندا ، رقم المنحة 2019/33 / B / NZ5 / 00647. نود أن نشكر البروفيسور توماس جوسيفسكي وأغنيسكا كراوتشيك من قسم علم الأحياء الدقيقة الطبية الجزيئية ، كلية الطب بجامعة جاجيلونيان على مساعدتهم التي لا تقدر بثمن في الكشف عن الحمض النووي البكتيري في المركبات الكهربائية.
Materials
| Alix (3A9) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2171 | |
| 1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic | GoogLab Scientific | GBFT1250-R-NS | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometr | BD Biosciences | ||
| CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II | BD Biosciences | 551809 | |
| CD9 (D8O1A) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13174 | |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 17001401 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| ELX800NB, Universal Microplate Reader | BIO-TEK INSTRUMENTS, INC | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | |
| Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin | Biowest | S1860-500 | |
| Gentamicin, 50 mg/mL | PAN – Biotech | P06-13100 | |
| Goat anti-Mouse IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Goat anti-Rabbit IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1620177 | |
| LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE) | Enzo Life Sciences, Inc. | ALX-581-009-L002 | |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703930 | |
| Nanoparticle Tracking Analysis | Malvern Instruments Ltd | ||
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Invitrogen | NP0004 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | transparent film |
| Perfect 100-1000 bp DNA Ladder | EURx | E3141-01 | |
| PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552 | |
| PP Oak Ridge Tube with sealing caps | Thermo Scientific | 3929, 03613 | |
| RPMI 1640 | RPMI-1640 (Gibco) | 11875093 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystem | A24811 | |
| Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor | Thermo Scientific | 75000100 | |
| Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1704401 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| SW480 cell line | American Type Culture Collection(ATCC) | ||
| SW480 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
| Syringe filter 0.22 um | TPP | 99722 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703940 | Transfer machine |
| Transfer pipette, 3.5 mL | SARSTEDT | 86.1171.001 |
References
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
- van Niel, G., et al. Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).
- Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Giα dependent PI-3 kinase signalling. Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).
- Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells. PLOS ONE. 9 (12), 113840 (2014).
- Zanoni, I., Granucci, F. Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32 (2013).
- Takashiba, S., et al. Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB. Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).
- Schwarz, H., et al. Biological activity of masked endotoxin. Scientific Reports. 7, 44750 (2017).
- Danesh, A., et al. Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients. Frontiers in Immunology. 9, 956 (2018).
- Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles. The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).
- Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells. Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).
- Soekmadji, C., et al. The future of Extracellular Vesicles as Theranostics – an ISEV meeting report. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766 (2020).
- Gioannini, T. L., et al. Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).
- Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test. Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).
- Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization. Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).
- Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. Hot EVs – How temperature affects extracellular vesicles. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).
- Osteikoetxea, X., et al. Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations. Organic & Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).
- Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications. International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216 (2019).
- Shintani, H. Ethylene oxide gas sterilization of medical devices. Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Salamon, D., et al. Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome. Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).
- Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes. Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).
- Chaiwut, R., Kasinrerk, W. Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes. BMC Research Notes. 15 (1), 42 (2022).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858 (2014).
- Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).
- Pham, C. V., et al. Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when ‘exosome-depleted serum’ is utilised. Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963 (2021).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).
- Álvarez, E., et al. A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins. Frontiers in Immunology. 8, 915 (2017).
- Busatto, S., et al. Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid. Cells. 7 (12), 273 (2018).
- Gałuszka, A., et al. Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227 (2020).
- Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies. Critical Care. 10 (1), 27 (2006).
- Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).
