Isolierung von extrazellulären Vesikeln mit niedrigem Endotoxingehalt, die aus Krebszelllinien stammen

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind nach der Nomenklatur MISEV 2018 ein Sammelbegriff, der verschiedene Subtypen von zellsezernierten membranösen Vesikeln beschreibt, die bei zahlreichen physiologischen und pathologischen Prozessen eine entscheidende Rolle spielen ^1,2. Darüber hinaus sind Elektrofahrzeuge als neuartige Biomarker für verschiedene Krankheiten sowie als Therapeutika und Vehikel für die Verabreichung von Medikamenten vielversprechend. Es ist jedoch schwierig, ihr volles Potenzial auszuschöpfen, da es immer noch viele technische Hindernisse im Zusammenhang mit ihrer Anschaffung^{gibt 3}. Eine solche Herausforderung ist die Isolierung von endotoxinfreien Elektrofahrzeugen, die in vielen Fällen vernachlässigt wurde. Eines der häufigsten Endotoxine ist das Lipopolysaccharid (LPS), das ein Hauptbestandteil gramnegativer bakterieller Zellwände ist und aufgrund der Freisetzung einer großen Anzahl von entzündlichen Zytokinen durch verschiedene Zellen eine akute Entzündungsreaktion hervorrufen kann ^4,5. LPS induziert eine Reaktion durch Bindung an das LPS-bindende Protein, gefolgt von einer Interaktion mit dem CD14/TLR4/MD2-Komplex auf myeloischen Zellen. Diese Wechselwirkung führt zur Aktivierung von MyD88- und TRIF-abhängigen Signalwegen, was wiederum den Kernfaktor Kappa B (NFkB) auslöst. Die Translokation von NFkB in den Zellkern initiiert die Produktion von Zytokinen⁶. Monozyten und Makrophagen reagieren sehr empfindlich auf LPS, und ihre Exposition gegenüber LPS führt zu einer Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen (z. B. IL-6, IL-12, CXCL8 und TNF-α)^7,8. Die CD14-Struktur ermöglicht die Bindung verschiedener LPS-Spezies mit ähnlicher Affinität und dient als Co-Rezeptor für andere Toll-like-Rezeptoren (TLRs) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 und 9)⁶. Die Zahl der Studien, die zu den Auswirkungen von EVs auf Monozyten/Makrophagen durchgeführt werden, nimmt immer noch zu 9,10,11. Insbesondere im Hinblick auf die Untersuchung der Funktionen von Monozyten, ihren Subpopulationen und anderen Immunzellen ist das Vorhandensein von Endotoxin und sogar ihre maskierte Anwesenheit in EVs von großer Bedeutung¹². Die übersehene Kontamination von Elektrofahrzeugen mit Endotoxinen kann zu irreführenden Schlussfolgerungen führen und ihre wahre biologische Aktivität verschleiern. Mit anderen Worten, die Arbeit mit monozytären Zellen erfordert Vertrauen in die Abwesenheit einer Endotoxinkontamination¹³. Mögliche Quellen für Endotoxine können Wasser, kommerziell erhältliche Medien und Seren, Medienkomponenten und -additive, Laborglaswaren und Kunststoffwaren 5,14,15 sein.

Daher zielte diese Studie darauf ab, ein Protokoll für die Isolierung von niedrig endotoxinhaltigen EVs zu entwickeln. Das Protokoll enthält einfache Hinweise, wie eine Endotoxinkontamination während der Isolierung von Elektrofahrzeugen vermieden werden kann, anstatt Endotoxine aus Elektrofahrzeugen zu entfernen. Zuvor wurden viele Protokolle vorgestellt, wie Endotoxine beispielsweise aus technisch hergestellten Nanopartikeln entfernt werden können, die in der Nanomedizin verwendet werden. Keiner von ihnen ist jedoch für biologische Strukturen wie EVs nützlich. Die effektive Depyrogenisierung von Nanopartikeln kann durch Ethanol- oder Essigsäurespülen, Erhitzen auf 175 °C für 3 h, γ Bestrahlung oder Triton-X-100-Behandlung erfolgen; Diese Verfahren führen jedoch zur Zerstörung von Elektrofahrzeugen^16,17.

Das vorgestellte Protokoll ist eine bahnbrechende Studie, die sich auf die Vermeidung von Endotoxinverunreinigungen in EVs konzentriert, im Gegensatz zu früheren Studien zur Wirkung von EVs auf Monozyten⁹. Die Anwendung der vorgeschlagenen Prinzipien auf die Laborpraxis kann dazu beitragen, zuverlässige Forschungsergebnisse zu erhalten, was entscheidend sein kann, wenn die mögliche Verwendung von EVs als Therapeutika in der Klinik in Betracht gezogen wird¹².