Isolement de vésicules extracellulaires à faible teneur en endotoxines dérivées de lignées cellulaires cancéreuses

Les vésicules extracellulaires (VE), selon la nomenclature MISEV 2018, sont un terme collectif décrivant divers sous-types de vésicules membraneuses sécrétées par des cellules qui jouent un rôle crucial dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques ^1,2. De plus, les véhicules électriques sont prometteurs en tant que nouveaux biomarqueurs pour diverses maladies, ainsi qu’en tant qu’agents thérapeutiques et véhicules d’administration de médicaments. Cependant, la réalisation de leur plein potentiel est difficile car il existe encore de nombreux obstacles techniques liés à leur acquisition³. L’un de ces défis est l’isolement des véhicules électriques exempts d’endotoxines, qui a été négligé dans de nombreux cas. L’une des endotoxines les plus courantes est le lipopolysaccharide (LPS), qui est un composant majeur des parois cellulaires bactériennes à Gram négatif et peut provoquer une réponse inflammatoire aiguë, en raison de la libération d’un grand nombre de cytokines inflammatoires par diverses cellules ^4,5. Le LPS induit une réponse en se liant à la protéine de liaison LPS, suivie d’une interaction avec le complexe CD14/TLR4/MD2 sur les cellules myéloïdes. Cette interaction conduit à l’activation des voies de signalisation dépendantes de MyD88 et TRIF, qui à son tour déclenche le facteur nucléaire kappa B (NFkB). La translocation de NFkB vers le noyau initie la production de cytokines⁶. Les monocytes et les macrophages sont très sensibles au LPS, et leur exposition au LPS entraîne la libération de cytokines et de chimiokines inflammatoires (p. ex. IL-6, IL-12, CXCL8 et TNF-α)^7,8. La structure CD14 permet la liaison de différentes espèces de LPS ayant une affinité similaire et sert de corécepteur pour d’autres récepteurs de type Toll (TLR) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 et 9)⁶. Le nombre d’études menées sur les effets des VE sur les monocytes/macrophages continue d’augmenter 9,10,11. Surtout du point de vue de l’étude des fonctions des monocytes, de leurs sous-populations et d’autres cellules immunitaires, la présence d’endotoxines et même leur présence masquée dans les VE est d’une grande importance¹². La contamination négligée des VE par des endotoxines peut conduire à des conclusions trompeuses et cacher leur véritable activité biologique. En d’autres termes, travailler avec des cellules monocytaires nécessite de faire confiance à l’absence de contamination par les endotoxines¹³. Les sources potentielles d’endotoxines peuvent être l’eau, les milieux et sérums obtenus commercialement, les composants et additifs de médias, la verrerie de laboratoire et la vaisselle en plastique 5,14,15.

Par conséquent, cette étude visait à développer un protocole pour l’isolement des VE à faible teneur en endotoxines. Le protocole fournit des conseils simples sur la façon d’éviter la contamination par les endotoxines pendant l’isolement des VE au lieu d’éliminer les endotoxines des VE. Auparavant, de nombreux protocoles ont été présentés sur la façon d’éliminer les endotoxines, par exemple des nanoparticules modifiées utilisées en nanomédecine; cependant, aucun d’entre eux n’est utile pour les structures biologiques telles que les véhicules électriques. La dépyrogénation efficace des nanoparticules peut être réalisée par rinçage à l’éthanol ou à l’acide acétique, chauffage à 175 °C pendant 3 h, irradiation γ ou traitement au triton X-100; cependant, ces procédures conduisent à la destruction des VE^16,17.

Le protocole présenté est une étude pionnière axée sur l’évitement des impuretés endotoxines dans les VE, contrairement aux études précédentes sur l’effet des VE sur les monocytes⁹. L’application des principes proposés à la pratique de laboratoire peut aider à obtenir des résultats de recherche fiables, ce qui peut être crucial lors de l’examen de l’utilisation potentielle des VE comme agents thérapeutiques en clinique¹².