בידוד של תכולת אנדוטוקסין נמוכה שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בשורות תאים סרטניים
Summary
הפרוטוקול המוצע כולל הנחיות כיצד להימנע מזיהום באנדוטוקסין במהלך בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות מסופרנאטנטים של תרביות תאים, וכיצד להעריך אותן כראוי.
Abstract
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן אוכלוסייה הטרוגנית של שלפוחיות ממברנות המשוחררות על ידי תאים במבחנה ו-in vivo. נוכחותם בכל מקום ותפקידם המשמעותי כנשאים של מידע ביולוגי הופכים אותם למושאי מחקר מסקרנים, הדורשים פרוטוקולים אמינים וחוזרים על עצמם לבידודם. עם זאת, מימוש מלוא הפוטנציאל שלהם הוא קשה מכיוון שעדיין ישנם מכשולים טכניים רבים הקשורים למחקר שלהם (כמו רכישה נכונה). מחקר זה מציג פרוטוקול לבידוד כלי רכב חשמליים קטנים (על פי המינוח MISEV 2018) מהתרבית של קווי תאי הגידול המבוססת על צנטריפוגה דיפרנציאלית. הפרוטוקול כולל הנחיות כיצד להימנע מזיהום באנדוטוקסינים במהלך בידוד של כלי רכב חשמליים וכיצד להעריך אותם כראוי. זיהום אנדוטוקסין של כלי רכב חשמליים יכול לעכב באופן משמעותי ניסויים עתידיים או אפילו להסוות את ההשפעות הביולוגיות האמיתיות שלהם. מצד שני, נוכחות התעלמות של אנדוטוקסינים עלולה להוביל למסקנות שגויות. יש לכך חשיבות מיוחדת כאשר מתייחסים לתאים של מערכת החיסון, כולל מונוציטים, מכיוון שמונוציטים מהווים אוכלוסייה רגישה במיוחד לשאריות אנדוטוקסין. לכן, מומלץ מאוד לסנן כלי רכב חשמליים לאיתור זיהום אנדוטוקסין, במיוחד כאשר עובדים עם תאים רגישים לאנדוטוקסין כגון מונוציטים, מקרופאגים, תאים מדכאים שמקורם במיאלואידים או תאים דנדריטיים.
Introduction
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs), על פי המינוח MISEV 2018, הן מונח קולקטיבי המתאר תת-סוגים שונים של שלפוחיות קרומיות המופרשות על ידי תאים הממלאות תפקידים מכריעים בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים 1,2. יתר על כן, כלי רכב חשמליים נראים מבטיחים כסמנים ביולוגיים חדשניים למחלות שונות, כמו גם סוכנים טיפוליים וכלי רכב לאספקת תרופות. עם זאת, מימוש מלוא הפוטנציאל שלהם הוא קשה שכן ישנם עדיין מכשולים טכניים רבים הקשורים לרכישתם3. אתגר אחד כזה הוא הבידוד של כלי רכב חשמליים נטולי אנדוטוקסין, שהוזנח במקרים רבים. אחד האנדוטוקסינים הנפוצים ביותר הוא ליפופוליסכריד (LPS), שהוא מרכיב עיקרי בדפנות תאי חיידקים גראם-שליליים ויכול לגרום לתגובה דלקתית חריפה, עקב שחרור מספר רב של ציטוקינים דלקתיים על ידי תאים שונים 4,5. LPS משרה תגובה על ידי קשירה לחלבון קושר LPS, ואחריו אינטראקציה עם קומפלקס CD14/TLR4/MD2 על תאים מיאלואידים. אינטראקציה זו מובילה להפעלה של מסלולי איתות תלויי MyD88 ו- TRIF, אשר בתורו מפעיל את הגורם הגרעיני קאפה B (NFkB). טרנסלוקציה של NFkB לגרעין יוזמת ייצור ציטוקינים6. מונוציטים ומקרופאגים רגישים מאוד ל-LPS, וחשיפתם ל-LPS גורמת לשחרור ציטוקינים וכימוקינים דלקתיים (למשל, IL-6, IL-12, CXCL8 ו-TNF-α)7,8. מבנה CD14 מאפשר קשירה של מיני LPS שונים בעלי זיקה דומה ומשמש כקולטן משותף לקולטנים דמויי אגרה אחרים (TLRs) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 ו-9)6. מספר המחקרים הנערכים על ההשפעות של כלי רכב חשמליים על מונוציטים/מקרופאגים עדיין גדל ב-9,10,11. במיוחד מנקודת המבט של חקר תפקודם של מונוציטים, תת-אוכלוסיות שלהם ותאים חיסוניים אחרים, נוכחותם של אנדוטוקסין ואפילו נוכחותם המוסווית ברכבים חשמליים היא בעלת חשיבות רבה12. הזיהום המתעלם של כלי רכב חשמליים באנדוטוקסינים עלול להוביל למסקנות מטעות ולהסתיר את פעילותם הביולוגית האמיתית. במילים אחרות, עבודה עם תאים מונוציטיים דורשת ביטחון בהיעדר זיהום אנדוטוקסין13. מקורות פוטנציאליים של אנדוטוקסינים יכולים להיות מים, מדיה מסחרית וסרה, רכיבי מדיה ותוספים, כלי זכוכית מעבדה וכלי פלסטיק 5,14,15.
לכן, מחקר זה נועד לפתח פרוטוקול לבידוד של כלי רכב חשמליים בעלי אנדוטוקסין נמוך. הפרוטוקול מספק רמזים פשוטים כיצד להימנע מזיהום אנדוטוקסין במהלך בידוד כלי רכב חשמליים, במקום להסיר אנדוטוקסינים מכלי רכב חשמליים. בעבר, פרוטוקולים רבים הוצגו כיצד להסיר אנדוטוקסינים מננו-חלקיקים מהונדסים המשמשים בננו-רפואה; עם זאת, אף אחד מהם אינו שימושי עבור מבנים ביולוגיים כגון כלי רכב חשמליים. דפירוגנציה יעילה של ננו-חלקיקים יכולה להתבצע על ידי שטיפת אתנול או חומצה אצטית, חימום ב 175 ° C במשך 3 שעות, γ הקרנה, או טיפול טריטון X-100; עם זאת, נהלים אלה מובילים להשמדת כלי רכב חשמליים16,17.
הפרוטוקול המוצג הוא מחקר חלוצי המתמקד במניעת זיהומים אנדוטוקסינים ברכב חשמלי, בניגוד למחקרים קודמים על השפעת כלי רכב חשמליים על מונוציטים9. יישום העקרונות המוצעים לפרקטיקה במעבדה עשוי לסייע בהשגת תוצאות מחקר אמינות, אשר יכולות להיות חיוניות כאשר שוקלים את השימוש הפוטנציאלי של כלי רכב חשמליים כסוכנים טיפוליים במרפאה12.
Protocol
Representative Results
Discussion
בשנים האחרונות, שיטות לבידוד נכון של כלי רכב חשמליים הפכו חשובות יותר ויותר, ומאפשרות ניתוחים אמינים נוספים, למשל, בהקשר של קבלת אומיקה מהימנה ונתונים פונקציונליים24. בהתבסס על ניסיון מחקרי קודם, נראה כי לא רק סוג שיטת הבידוד, אלא גם תנאים אחרים במהלך הליך זה עשויים להיות חשובי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הלאומי למדע, פולין, מענק מספר 2019/33/B/NZ5/00647. ברצוננו להודות לפרופ’ תומאש גוסייבסקי ואגניישקה קרבצ’יק מהמחלקה למיקרוביולוגיה רפואית מולקולרית, המכללה הרפואית של האוניברסיטה היגלונית על עזרתם רבת הערך בזיהוי דנ”א חיידקי ברכבים חשמליים.
Materials
| Alix (3A9) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2171 | |
| 1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic | GoogLab Scientific | GBFT1250-R-NS | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometr | BD Biosciences | ||
| CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II | BD Biosciences | 551809 | |
| CD9 (D8O1A) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13174 | |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 17001401 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| ELX800NB, Universal Microplate Reader | BIO-TEK INSTRUMENTS, INC | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | |
| Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin | Biowest | S1860-500 | |
| Gentamicin, 50 mg/mL | PAN – Biotech | P06-13100 | |
| Goat anti-Mouse IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Goat anti-Rabbit IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1620177 | |
| LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE) | Enzo Life Sciences, Inc. | ALX-581-009-L002 | |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703930 | |
| Nanoparticle Tracking Analysis | Malvern Instruments Ltd | ||
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Invitrogen | NP0004 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | transparent film |
| Perfect 100-1000 bp DNA Ladder | EURx | E3141-01 | |
| PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552 | |
| PP Oak Ridge Tube with sealing caps | Thermo Scientific | 3929, 03613 | |
| RPMI 1640 | RPMI-1640 (Gibco) | 11875093 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystem | A24811 | |
| Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor | Thermo Scientific | 75000100 | |
| Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1704401 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| SW480 cell line | American Type Culture Collection(ATCC) | ||
| SW480 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
| Syringe filter 0.22 um | TPP | 99722 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703940 | Transfer machine |
| Transfer pipette, 3.5 mL | SARSTEDT | 86.1171.001 |
References
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
- van Niel, G., et al. Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).
- Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Giα dependent PI-3 kinase signalling. Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).
- Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells. PLOS ONE. 9 (12), 113840 (2014).
- Zanoni, I., Granucci, F. Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32 (2013).
- Takashiba, S., et al. Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB. Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).
- Schwarz, H., et al. Biological activity of masked endotoxin. Scientific Reports. 7, 44750 (2017).
- Danesh, A., et al. Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients. Frontiers in Immunology. 9, 956 (2018).
- Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles. The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).
- Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells. Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).
- Soekmadji, C., et al. The future of Extracellular Vesicles as Theranostics – an ISEV meeting report. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766 (2020).
- Gioannini, T. L., et al. Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).
- Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test. Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).
- Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization. Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).
- Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. Hot EVs – How temperature affects extracellular vesicles. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).
- Osteikoetxea, X., et al. Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations. Organic & Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).
- Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications. International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216 (2019).
- Shintani, H. Ethylene oxide gas sterilization of medical devices. Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Salamon, D., et al. Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome. Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).
- Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes. Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).
- Chaiwut, R., Kasinrerk, W. Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes. BMC Research Notes. 15 (1), 42 (2022).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858 (2014).
- Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).
- Pham, C. V., et al. Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when ‘exosome-depleted serum’ is utilised. Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963 (2021).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).
- Álvarez, E., et al. A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins. Frontiers in Immunology. 8, 915 (2017).
- Busatto, S., et al. Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid. Cells. 7 (12), 273 (2018).
- Gałuszka, A., et al. Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227 (2020).
- Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies. Critical Care. 10 (1), 27 (2006).
- Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).
