Effiziente und konsistente Generierung von retinalen Pigmentepithel-/Aderhaut-Flatmounts aus dem menschlichen Auge für die histologische Analyse

Die menschlichen Globen von Leichen wurden vom Advanced Sight Network (Birmingham, AL) bezogen. Arbeiten an Leichengewebe werden vom NIH Institutional Review Board vom Forschungsethikausschuss ausgenommen. 1. Augenglobus Versand Nach der Enukleation frische Augenkugeln in einem Behälter verschicken, der 1x mit eiskaltem DPBS mit Ca2+ undMg2+ gefüllt ist.HINWEIS: Es ist besser, das Auge innerhalb von 24 Stunden nach der Enukleation zu analysieren. Die RPE-Morphologie wird in diesem Zeitfenster nicht verändert. 2. Silikonformvorbereitung Schneiden Sie die unteren 20 mm eines Rundbodenrohrs mit einem Durchmesser von 25 mm ab. Legen Sie es auf die Basis eines quadratischen Wiegebootes (81 mm x 81 mm x 25 mm). Mischen Sie die beiden Komponenten des Silikon-Elastomer-Kits im Verhältnis 10:1 und achten Sie darauf, keine Luft einzuschließen. Gießen Sie die Mischung in das Wiegeboot, das das kugelförmige Stück des Rundbodenrohrs enthält. Das Silikon über Nacht bei Raumtemperatur aushärten. Entfernen Sie das Wiegegefäß und das Rundrohr aus der ausgehärteten Silikonform. 3. RPE-Dissektion Reinigen Sie die Sklera von der frischen Augenkugel von Muskeln und Bindegewebe. Befestigen Sie das Auge mit 27 G-Nadeln, die durch die Sklera gefädelt werden, an der Silikonform. Füllen Sie den Hohlraum der Form mit DPBS 1x mit Ca2+ undMg2+.HINWEIS: Achten Sie darauf, die Augenkammer nicht zu durchbrechen. Die Nadeln sollten nur durch die Sklera gehen. Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze und eine 21-g-Nadel, um ~400 μL 1.700 mOsm D-Mannitol-Lösung in den Glaskörper zu injizieren. Führen Sie die Nadel durch die Pars Plana ein, um eine Punktion der Vorderkammer des Auges zu vermeiden. Lassen Sie das Auge bei Raumtemperatur für ~45 min. Schneiden Sie die Vorderkammer auf Höhe der Pars plana mit einer feinen Schere und einer Pinzette auf. Füllen Sie die hintere Augenkammer mit DPBS 1x mit Ca2+ undMg2+. Unter dem Stereomikroskop lokalisieren Sie die Makula (den gelben Fleck auf der Netzhaut). Wenn ein chirurgischer Glaskörperschneider zur Verfügung steht, entfernen Sie den Glaskörper und ersetzen Sie ihn durch DPBS 1x mit Ca 2+ und Mg2+. Alternativ können Sie versuchen, den Glaskörper mit einer Pinzette anzuheben und mit einer feinen Schere zu schneiden. Achten Sie darauf, die Makularegion zu erhalten, schneiden Sie das Auge in Quadranten: nasal, temporal, superior und inferior. Entfernen Sie die Nadeln, wenn sie im Weg sind. Überführen Sie die schmetterlingshintere Augenkammer in eine 100 mm Petrischale, die DPBS 1x mit Ca2+ und Mg2+ enthält. Bevor Sie die Netzhaut entfernen, markieren Sie das Blütenblatt, das die Makula enthält, indem Sie einen kleinen Schnitt (V-förmig) im Ziliarand machen. Heben und schneiden Sie den gesamten Glaskörper, der auf der Netzhaut liegt. Heben Sie die Netzhaut vorsichtig von mehreren Seiten mit einem gekrümmten Spatel oder einer Pinzette an, um zu überprüfen, ob sich die Netzhaut vom RPE gelöst hat, und um etwas Flüssigkeit zwischen den beiden Schichten zirkulieren zu lassen.HINWEIS: Die Netzhaut wird immer noch an der äußersten Peripherie (Ziliarrand) und am Sehnerv befestigt. Schneiden Sie die Netzhaut von den Ziliarändern in allen Blütenblättern ab und stellen Sie sicher, dass das RPE nicht zerkratzt wird. Legen Sie das Gewebe in 4% PFA und inkubieren Sie für ~ 1 h. 3x mit DPBS waschen, 1x mit Ca2+ undMg2+. Das Gewebe in einen mit DPBS 1x mit Ca2+ undMg2+ gefüllten Behälter überführen und bei 4 °C lagern.HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt ist die Netzhaut nur am Sehnerv befestigt. Dies ist ein Pausenpunkt in diesem Experiment. Die Probe wird in eine 100-mm-Petrischale überführt, die DPBS 1x mit Ca2+ undMg2+ enthält. Stanzen Sie den Sehnervenkopf mit einem 1,5-mm-Biopsiestempel aus und entnehmen Sie die Netzhaut. Lagern Sie die neurale Netzhaut in DPBS 1x mit Ca2+ undMg2+ bei 4 °C.HINWEIS: Bevor Sie den Sehnervenkopf ausstanzen, achten Sie darauf, den Sehnerv so weit wie möglich auf der Skleraseite zu schneiden. Dies erhöht die Präzision des Stempels. Das Ausstanzen des Sehnervs, nachdem der Flatmount in 4% PFA fixiert wurde, reduziert die Schädigung der RPE-Zellen, die sich um den Sehnerv befinden. Entfernen Sie die Sklera aus dem RPE/Aderhaut, indem Sie die RPE/Aderhautschicht vorsichtig von der Peripherie abheben und die Aderhautgefäße und das Bindegewebe, die sich zwischen der Sklera und dem RPE befinden, mit einer Vannas-Federschere durchtrennen. Sobald die RPE/Aderhaut vollständig von der Sklera getrennt ist, sammeln Sie die RPE/Aderhautschicht. Das Gewebe in einen mit DPBS 1x mit Ca2+ undMg2+ gefüllten Behälter überführen und bei 4°C lagern.HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt kann das Experiment pausiert werden. 4. Färbung Übertragen Sie die RPE/Aderhaut in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte. Blockieren und permeabilisieren Sie die Probe in DPBS 1x mit Ca2+ undMg2+ mit 1% Rinderserumalbumin (BSA), 0,5% Tween 20 und 0,5% Triton X-100 für 1 h bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie die Probe mit Phalloidin, das mit einem 647-Fluorophor konjugiert ist, in einer Verdünnung von 1:250 in DPBS 1x mit Ca 2+ und Mg2 mit 1 % BSA, 0,5 % Tween20 und 0,5 % Triton X-100 für 1 h bei Raumtemperatur. 3x in DPBS 1x mit Ca2+ undMg2+ waschen. Übertragen Sie die RPE/Aderhautprobe auf einen 50 mm x 75 mm großen Glasobjektträger und glätten Sie ihn. Schneiden Sie jedes “Blütenblatt” in zwei Teile, um die Probe flacher zu machen. Achten Sie auf die Makula. Zeichne mit einem hydrophoben Stift eine Kontur des Flatmounts. Um die Lipofuszin-Autofluoreszenz zu löschen, werden 500 μl der auf 1:20 verdünnten Autofluoreszenzlöschlösung in 70%igem Ethanol zugegeben und bei Raumtemperatur für 2 min inkubiert. Gründlich (mindestens 3x) in DPBS 1x mit Ca2+ undMg2+ waschen. Entfernen Sie den DPBS und fügen Sie das Einhängemedium hinzu. Legen Sie ein Deckglas auf das Flatmount und versiegeln Sie es mit Nagellack. Fotografieren Sie den Flatmount mit einem Fluoreszenzmikroskop (vorzugsweise mit einem 10-fachen oder 20-fachen Objektiv). 5. REShAPE-Analyse HINWEIS: Da der KI-basierte Algorithmus von REShAPE mit 10x- und 20x-Bildern trainiert wurde, wird dringend empfohlen, bei der Bildgebung ein 10x- oder 20x-Objektiv zu verwenden . Ist dies nicht der Fall, müssen die Bilder entsprechend skaliert werden. Wenn die Bilder mit mehr als einem Fluoreszenzkanal aufgenommen werden, isolieren Sie den Kanal, der zur Erfassung der Zellränder verwendet wird. Exportieren Sie die Bilder als 16-Bit-Graustufen-TIF-Dateien.HINWEIS: Bilder, die mit der Dateiendung .czi aufgenommen wurden, müssen nicht als TIF-Dateien exportiert werden, aber der Kanal, der die Zellenränder enthält, muss noch isoliert werden. Installieren Sie die Software auf Windows x64- oder Linux-Plattformen (Centos 7).HINWEIS: Die Software und die Installationsanweisungen finden Sie unter https://github.com/nih-nei/REShAPE. Öffnen Sie die Software (Abbildung 1). Wählen Sie auf der Registerkarte Verzeichnisse die Eingabe- und Ausgabeordner aus. Wählen Sie im Eingabeverzeichnis den Ordner aus, der die Bilder enthält. Lassen Sie die Software im Ausgabeverzeichnis automatisch den Pfad in ” Eingabeverzeichnis/Verarbeitet” ändern. Alternativ können Sie das Ausgabeverzeichnis auch manuell ändern.HINWEIS: Die Software durchläuft alle Bilder, die im Eingabeordner enthalten sind. Wählen Sie auf der Registerkarte NN-Segmentierungsoptionen die folgenden Einstellungen für die Bildsegmentierung aus:Batchgröße: Geben Sie einen Wert von 20 in das Textfeld als guten Ausgangspunkt ein, senken Sie ihn jedoch, wenn das System keine Grafikprozessoren (GPUs) mehr hat.HINWEIS: Das Originalbild wird zur Bearbeitung in kleinere Kacheln aufgeteilt. Die Batchgröße gibt an, wie viele Kacheln gleichzeitig verarbeitet werden können. GPU verwenden?: Wenn das System nicht über genügend GPU-Ressourcen verfügt, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Nein. Interne Skalierung: Ändern Sie über das Dropdown-Menü die interne Skalierung von “Keine “, wenn die Bilder nicht mit einem 10-fachen oder 20-fachen Objektiv aufgenommen wurden. Skalieren Sie beispielsweise 40-fache Bilder mit der 1/2-Taste auf die halbe Größe. Die im Dropdown-Menü verfügbaren Optionen für die Neuskalierung sind wie folgt: 5x, 2x, Keine, 1/2, 1/5.HINWEIS: Das maschinelle Lernen wurde mit 10x- und 20x-Bildern trainiert. Es kann sein, dass Zellränder von Bildern, die mit anderen Vergrößerungen aufgenommen wurden, nicht erkannt werden. In diesem Fall werden binäre Bilder vollständig schwarz angezeigt. Arti-Filter: Verwenden Sie den Artefaktfilter, um sehr helle Partikel (Trümmer oder kleine Teile der Netzhaut oder des Bindegewebes um den Sehnerv herum) zu entfernen, die im Bild vorhanden sein können und die Segmentierung der Zellgrenzen stören können. Standardmäßig wird kein Filter verwendet. Die künstlichen Filteroptionen im Dropdown-Menü lauten wie folgt: Normal, Stark und Schwach. Fügen Sie auf der Registerkarte Kachelbildoption einen Wert in das Textfeld ein, um den Grad der Überlappung zwischen den Bildkacheln anzugeben, indem Sie den Parameter ” Kacheln auffüllen nach” anpassen. Eine Überlappung von 100 Pixeln funktioniert in der Regel gut. Passen Sie auf der Registerkarte “Ausgabegrafikoptionen ” die Einstellungen für die Heatmap-Generierung an:Kachelbilder rekonstruieren?: Wenn das System nicht über genügend Ressourcen für die Analyse großer Bilder verfügt, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Nein , damit die Software die Analyse abschließen kann, indem sie einzelne Kacheln speichert, ohne das gesamte Bild zu rekonstruieren. Farbbilder erstellen: Um Heatmaps zu erstellen, wählen Sie ” Alle ” aus dem Dropdown-Menü. Wählen Sie für die Färbung eine der verschiedenen Farbpaletten aus, die im Dropdown-Menü verfügbar sind: Thermisch, Grün, Mpl-Magma, Phase, Feuer, Jet, Cyan Hot. Speichern Sie die Bilder unter Bildformat als TIF oder PNG, indem Sie eine der Optionen auf der Registerkarte auswählen. Aktivieren Sie in Bezug auf die Funktion “Manuelle Grenzwerte verwenden?” das Kontrollkästchen Nein , damit die Software die in jedem Bild erkannten Minimal- und Maximalwerte verwenden kann. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Ja , um den Wertebereich für jede Heatmap der Formmetrik manuell anzupassen, und klicken Sie auf die Schaltfläche Grenzwerte festlegen , um Bereiche für die einzelnen Parameter auszuwählen, indem Sie Werte in die Textfelder einfügen. Nachdem Sie die gewünschten Werte geändert haben, klicken Sie auf Speichern. Klicken Sie auf Standardwerte laden , um alle Grenzwerte zurückzusetzen.HINWEIS: Verwenden Sie manuelle Grenzwerte, wenn Heatmaps aus mehreren Bildern verglichen werden müssen, z. B. beim Vergleich der Auswirkungen verschiedener Verbindungen auf die Zellform. Auf diese Weise wird derselbe Wertebereich verwendet. Der Satz der manuell einzugebenden Werte variiert je nach Art der Probe. Es wird empfohlen, einige Iterationen auszuführen, um den optimalen Bereich auszuwählen. Wählen Sie auf der Registerkarte Zellengrößenbeschränkungen für die Analyse einen Schwellenwert für die Zellengröße für die Analyse aus:Geben Sie unter Niedrigere Zellengröße die Größe der kleinsten Zelle in das Textfeld ein, die in die Analyse einbezogen werden soll. Geben Sie unter Obere Zellengröße die Größe der größten Zelle in das Textfeld ein, die in die Analyse einbezogen werden soll.HINWEIS: Die Einheit der Zellengröße ändert sich von Pixeln zu Mikrometern im Quadrat, abhängig von der Option, die auf der Registerkarte ” Automatische Einheitenumrechnung” ausgewählt wurde. Wählen Sie auf der Registerkarte Automatische Einheitenumrechnung die bevorzugte Einheit für die Analyse aus:Aktivieren Sie unter Pixel in reale Einheiten konvertieren? das Kontrollkästchen Nein , um die Analyse in Pixeleinheiten auszuführen. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Ja , um die Analyse in Mikrometern auszuführen. Geben Sie unter Länge des Maßstabsbalkens (Pixel) den Pixelwert in das Textfeld ein. Geben Sie unter Länge des Maßstabsbalkens (Mikrometer) den entsprechenden Abstand in Mikrometern in das Textfeld ein. Um die Analyse zu starten, klicken Sie auf Go For It.HINWEIS: Die Software kann auch die Lebensfähigkeit der Zellen messen, wenn die Zellen mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) und Propidiumiodid gefärbt sind (Registerkarte CZI-Optionen ), dies gilt jedoch nicht für RPE-Flatmounts. Abbildung 1: Grafische Benutzeroberfläche von REShAPE. Die grafische Benutzeroberfläche verfügt über verschiedene Registerkarten zum Auswählen der Arbeitsverzeichnisse (Registerkarte Verzeichnisse ), zum Ändern der Segmentierungsoptionen (Registerkarten NN-Segmentierungsoptionen und Kachelbildoptionen ), zum Festlegen der Parameter für die Analyse (Zellengrößenbeschränkungen für die Analyse und zur automatischen Einheitenumrechnung ) und für die Heatmap-Generierung (Registerkarte Ausgabegrafikoptionen ). Abkürzung: GUI = grafische Benutzeroberfläche. 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