نحن نصف طريقة لفصل ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) بكفاءة عن شبكية العين في عيون الإنسان وتوليد حوامل مسطحة RPE / المشيمية كاملة للتحليلات النسيجية والمورفومترية ل RPE.
ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) والشبكية هي أنسجة متصلة وظيفيا وهيكليا تعمل معا لتنظيم إدراك الضوء والرؤية. ترتبط البروتينات الموجودة على السطح القمي RPE ارتباطا وثيقا بالبروتينات الموجودة على سطح الجزء الخارجي للمستقبلات الضوئية ، مما يجعل من الصعب فصل RPE باستمرار عن المستقبلات الضوئية / شبكية العين. لقد طورنا طريقة لفصل شبكية العين بكفاءة عن RPE للعيون البشرية لتوليد RPE / المشيمية والشبكية الكاملة للتحليل الخلوي المنفصل للمستقبلات الضوئية وخلايا RPE. أدى الحقن داخل الجسم الزجاجي لمحلول عالي الأسمولية من D-mannitol ، وهو سكر لا ينقله RPE ، إلى فصل RPE والشبكية عبر الغرفة الخلفية بأكملها دون التسبب في تلف تقاطعات خلايا RPE. لم يلاحظ وجود بقع RPE متصلة بالشبكية. أظهر وضع علامات Phalloidin على الأكتين الحفاظ على شكل RPE وسمح بالتحليل المورفومتري للظهارة بأكملها. تم تطوير برنامج قائم على الذكاء الاصطناعي (الذكاء الاصطناعي) للتعرف بدقة على حدود خلية RPE وتقسيمها وتحديد 30 مقياسا مختلفا للشكل. طريقة التشريح هذه قابلة للتكرار بشكل كبير ويمكن تمديدها بسهولة إلى نماذج حيوانية أخرى.
ترتبط ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) والشبكية العصبية ارتباطا وثيقا ببعضهما البعض بسبب الاعتماد الفسيولوجي القوي للمستقبلات الضوئية على RPE. أثناء التشريح ، يتسبب الفصل الميكانيكي للشبكية العصبية عن RPE في تمزق خلايا RPE ، مع بقاء الأجزاء القمية من RPE متصلة بالأجزاء الخارجية للمستقبلات الضوئية للشبكية. مدى التصاق الشبكية RPE كبير جدا لدرجة أن كمية الصباغ المتبقية على الشبكية بعد الانفصال تستخدم لتحديد قوة التصاق الشبكية1. على وجه التحديد ، تنقطع التقاطعات الضيقة RPE وهيكل الأكتين الذي يربطها ، والتي تقع على الجانب القمي ، أثناء الفصل الميكانيكي. لذلك ، يؤدي تلطيخ RPE Flatmounts لحدود الخلية إلى طبقة أحادية غير مكتملة يكون فيها للعديد من الخلايا حدود مفقودة. يتفاقم هذا التأثير عندما يتم تثبيت الأنسجة مع بارافورمالدهيد (PFA) قبل التشريح ، حيث تصبح البروتينات متشابكة.
أظهرت الدراسات التي أجريت على توصيل الدواء داخل الجسم الزجاجي أن حقن المحاليل المفرطة التناضح في الغرفة الخلفية تحفز انفصال الشبكية 2,3. في هذه التجارب ، تسبب حقن 50 ميكرولتر من المحاليل المختلفة ، التي تتراوح من 1000 mOsm إلى 2400 mOsm ، في منتصف الجسم الزجاجي في انفصال الشبكية في غضون دقائق. والجدير بالذكر أنه حتى بعد التعرض الطويل لمحاليل الأسمولية العالية ، ظهرت التقاطعات الضيقة RPE سليمة في الصور المجهرية الإلكترونية المرسلة لكل من عيون الأرانب والقرود3. باتباع استراتيجية مماثلة ، حقننا في منتصف الجسم الزجاجي محلول فرط التناضح من D-mannitol للحث على انفصال الشبكية الفعال قبل إجراء تشريح RPE. نظرا لأن D-mannitol لا يتم نقله بواسطة RPE4 ، يتم الحفاظ على تركيز عال داخل الجسم الزجاجي ، مما يولد تدرجا تناضحيا. يضمن الفصل الفعال ل RPE والشبكية عبر الغرفة الخلفية بأكملها الحفاظ على الوصلات الخلوية RPE ويسمح بدراسة مورفومترية RPE على الحامل المسطح بأكمله. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتطوير برنامج قائم على الذكاء الاصطناعي (الذكاء الاصطناعي) يتعرف على حدود خلايا RPE المسماة بالفلورسنت ويقسمها ، ويحدد 30 مقياسا مختلفا للشكل ، وينتج خرائط حرارية لكل مقياس للتصور 5,6.
يمكن تحقيق الفصل المتسق والفعال بين RPE البشري وشبكية العين باستخدام هذا البروتوكول. تسمح هذه الطريقة بدراسة الاختلافات الإقليمية في شكل RPE عبر شبكية العين البشرية بأكملها5. خطوة حاسمة في البروتوكول هي الفصل المادي ل RPE وشبكية العين. إذا لم يتم فصل النسيجين تماما في بعض المناطق ، فيجب على المرء رفع شبكية العين برفق ، مما يضمن عدم كسر الأنسجة. قد يتطلب تحليل REShAPE للحوامل المسطحة الكبيرة استخدام أنظمة ذات موارد ذاكرة وصول عشوائي كبيرة. في هذه الحالة ، يمكن تعطيل إعادة تجميع الصورة بأكملها للسماح للبرنامج بإنهاء التحليل بنجاح على الرغم من نقص موارد المعالجة.
يتمثل القيد الرئيسي لاستخدام REShAPE لتقسيم حوامل RPE البشرية في أن خوارزمية الذكاء الاصطناعي تم تدريبها في الغالب على صور RPE المستحثة المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات. نتيجة لذلك ، فإن تجزئة حوامل RPE البشرية أقل دقة. تحتوي خلايا RPE من المتبرعين المسنين على كمية كبيرة من lipofuscin7 ، ويتداخل الطيف الواسع من التألق الذاتي مع تجزئة حدود الخلية. في المستقبل ، سيتم استخدام المزيد من صور RPE flatmounts لتحسين تجزئة حدود الخلية في هذا النوع من العينات. على الرغم من هذا القيد، تم تدريب REShAPE خصيصا للتعرف على حدود خلايا RPE وتقسيمها وأداء أفضل من الطرق الأخرى الموجودة، مثل تجزئة خلايا RPE من Voronoi8 و CellProfiler9 .
علاوة على ذلك ، مقارنة بالتجزئة اليدوية 10 ، يوفر REShAPE ميزة تحليل الصور الكبيرة بسرعة (تم اختبار ~ 130,000 بكسل ×130,000 بكسل). في الختام ، طريقة التشريح هذه قابلة للتكرار بشكل كبير ويمكن تمديدها بسهولة إلى نماذج حيوانية أخرى. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام البرنامج لدراسة شكل RPE في حوامل العين المسطحة أو في نماذج زراعة الخلايا لفحص تأثير بعض العلاجات. أخيرا ، تعدد استخدامات REShAPE يجعلها قابلة للتطبيق على نطاق واسع لتحليل أنواع أخرى من الخلايا الظهارية.
The authors have nothing to disclose.
نشكر المعهد الوطني للعيون (NEI) مركز الأنسجة على استخدام Zeiss Axio Scan.Z1. كما نشكر المتبرعين وعائلاتهم وشبكة البصر المتقدم ومعهد ليونز للعيون على كرمهم. تم دعم هذا العمل من قبل صناديق NEI IRP (رقم المنحة ZIA EY000533-04).
Biopsy punch 1.5 mm | Acuderm Inc. | P1525 | |
Bovine albumin | MP Biomedicals | 160069 | |
Coverglass 50 x 75 mm, #1.5 thickness | Brain Research Laboratories | 5075-1.5D | |
Curved spatula | Katena | K3-6600 | |
D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
DPBS 1x with Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 14040-133 | |
Fine Scissors | Fine Science Tools | 14558-11 | |
Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
Microscope slides 50 x 75 x 1.2 mm | Brain Research Laboratories | 5075 | |
Needles 21 G x 1-1/2" hypodermic | Becton Dickinson (BD) | 305167 | |
Needles 27 G x 1-1/4" hypodermic | Becton Dickinson (BD) | 305136 | |
Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Petri dish 100 mm | Corning | 430167 | |
Phalloidin-iFluor 647 | Abcam | ab176759 | |
Razor blades | PAL (Personna) | 62-0177 | |
Round bottom tubes 50 mL | Newegg | 9SIA4SR9M88854 | |
Silicon Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 4019862 | |
Square weighing boat (81 mm x 81 mm x 25 mm) | Sigma | W2876 | |
Surgical Vitrectomy System | BD Visitrec | 585100 | optional |
Syringe 1 mL | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
TrueBlack | Biotium | 23007 | autofluorescence quencher |
Tween 20 | Affymetrix | 20605 | |
Vannas Spring Scissors – 3 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-10 |