Efficiënte en consistente generatie van retinale pigmentepitheel / choroïde flatmounts uit menselijke ogen voor histologische analyse

Kadaver menselijke globes werden verkregen van het Advanced Sight Network (Birmingham, AL). Werk uitgevoerd op kadaverweefsel is door de NIH Institutional Review Board vrijgesteld van de ethische commissie voor onderzoek. 1. Eye globe verzending Na enucleatie verschepen we verse oogbollen in een container gevuld met ijskoude DPBS 1x met Ca2+ en Mg2+.OPMERKING: Het is beter om het oog binnen 24 uur na enucleatie te ontleden. De RPE-morfologie wordt tijdens dit tijdvenster niet gewijzigd. 2. Siliconen schimmel voorbereiding Snijd de onderste 20 mm van een ronde bodembuis met een diameter van 25 mm. Plaats het aan de voet van een vierkante weegboot (81 mm x 81 mm x 25 mm). Meng de twee componenten van de Silicon Elastomer Kit in een verhouding van 10: 1, waarbij je er rekening mee houdt dat lucht niet wordt ingesloten. Giet het mengsel in de weegboot met daarin het bolvormige stuk van de buis met ronde bodem. Laat de siliconen een nacht op kamertemperatuur uitharden. Verwijder de weegboot en de buis met ronde bodem uit de uitgeharde siliconen mal. 3. RPE-dissectie Reinig de sclera van de frisse oogbol van spieren en bindweefsel. Bevestig het oog aan de siliconen mal met behulp van 27 G naalden die door de sclera zijn geregen. Vul de holte van de mal met DPBS 1x met Ca2+ en Mg2+.OPMERKING: Let op dat u de oogkamer niet doorbreekt. De naalden mogen alleen door de sclera. Gebruik een spuit van 1 ml en een naald van 21 g om ~ 400 μL van 1.700 mOsm D-mannitol-oplossing in het glasvocht te injecteren. Steek de naald door de pars plana om te voorkomen dat de voorste kamer van het oog wordt doorboord. Laat het oog ~45 min op kamertemperatuur staan. Knip de voorste kamer ter hoogte van de pars plana open met een fijne schaar en tang. Vul de achterste oogkamer met DPBS 1x met Ca2+ en Mg2+. Onder de stereomicroscoop lokaliseer je de macula (de gele vlek op het netvlies). Als er een chirurgische glasvochtsnijder beschikbaar is, verwijder dan het glasvocht en vervang het door DPBS 1x door Ca2+ en Mg2+. U kunt ook proberen het glasvocht met een tang op te tillen en met een fijne schaar te knippen. Let op het behoud van het maculagebied en snijd het oog in kwadranten: nasaal, temporal, superieur en inferieur. Verwijder de naalden als ze in de weg zitten. Breng de boterzachte achterste oogkamer over in een petrischaaltje van 100 mm met DPBS 1x met Ca2+ en Mg2+. Voordat u het netvlies verwijdert, markeert u het bloemblad dat de macula bevat door een kleine snede (V-vormig) in de ciliaire marge te maken. Til en snijd al het glasvocht dat op het netvlies ligt. Til het netvlies voorzichtig van meerdere kanten op met een gebogen spatel of een tang om te controleren of het netvlies is losgemaakt van de RPE en om wat vloeistof tussen de twee lagen te laten circuleren.OPMERKING: Het netvlies zal nog steeds aan de periferie (ciliaire marges) en aan de oogzenuw worden bevestigd. Snijd het netvlies van de ciliaire marges in alle bloemblaadjes en zorg ervoor dat u de RPE niet bekrast. Plaats het weefsel in 4% PFA en incubeer gedurende ~ 1 uur. Was 3x met DPBS 1x met Ca2+ en Mg2+. Breng het weefsel over in een container gevuld met DPBS 1x met Ca2+ en Mg2+ en bewaar het bij 4 °C.OPMERKING: Op dit punt is het netvlies alleen bevestigd aan de oogzenuw. Dit is een pauzepunt in dit experiment. Breng het monster over in een petrischaaltje van 100 mm met DPBS 1x met Ca2+ en Mg2+. Pons de oogzenuwkop uit met een biopsiestoot van 1,5 mm en verzamel het netvlies. Bewaar het neurale netvlies in DPBS 1x met Ca2+ en Mg2+ bij 4 °C.OPMERKING: Voordat u de oogzenuwkop uitslaat, moet u ervoor zorgen dat u de oogzenuw zoveel mogelijk aan de sclerale kant snijdt. Dit zal de precisie van de pons verhogen. Het uitstoten van de oogzenuw nadat de flatmount is gefixeerd in 4% PFA vermindert de schade aan de RPE-cellen rond de oogzenuw. Verwijder de sclera uit het RPE/vaatvlies door de RPE/vaatvlieslaag voorzichtig uit de periferie op te tillen en de vaatvliesvaten en het bindweefsel tussen de sclera en de RPE door te snijden met een Vannas-veerschaar. Zodra het RPE/vaatvlies volledig gescheiden is van de sclera, verzamel je de RPE/vaatvormige laag. Breng het weefsel over in een container gevuld met DPBS 1x met Ca2+ en Mg2+ en bewaar het bij 4°C.OPMERKING: Op dit moment kan het experiment worden onderbroken. 4. Vlekken Breng het RPE/vaatvlies over in een putje van een 6-well plaat. Blok en permeabiliseer het monster in DPBS 1x met Ca2+ en Mg2+ met 1% runderserumalbumine (BSA), 0,5% Tween 20 en 0,5% Triton X-100 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Incubeer het monster met falloidine geconjugeerd met een fluorofoor van 647 bij een verdunning van 1:250 in DPBS 1x met Ca2+ en Mg2+ met 1% BSA, 0,5% Tween 20 en 0,5% Triton X-100 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was 3x in DPBS 1x met Ca2+ en Mg2+. Breng het RPE/vaatvliesmonster over op een glasplaat van 50 mm x 75 mm en druk het plat. Snijd elk “bloemblad” in tweeën om het monster platter te maken. Let op de macula. Teken een contour van de flatmount met een hydrofobe pen. Om de lipofuscine-autofluorescentie te doven, voegt u 500 μL van de tot 1:20 verdunde autofluorescentie-oplossing toe aan 70% ethanol en incubeert u gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Was grondig (minstens 3x) in DPBS 1x met Ca2+ en Mg2+. Verwijder de DPBS en voeg het montagemedium toe. Leg een coverglas op de flatmount en sluit af met nagellak. Beeld de flatmount af met een fluorescentiemicroscoop (bij voorkeur met een 10x of 20x objectief). 5. REShAPE analyse OPMERKING: Aangezien het op REShAPE AI gebaseerde algoritme is getraind op 10x- en 20x-afbeeldingen, wordt het daarom ten zeerste aanbevolen om een 10x- of 20x-objectief te gebruiken bij het in beeld brengen. Zo niet, dan moeten de afbeeldingen dienovereenkomstig worden aangepast. Als de beelden met meer dan één fluorescerend kanaal worden verkregen, isoleert u het kanaal dat wordt gebruikt om de celranden te verkrijgen. Exporteer de afbeeldingen als 16-bits grijswaarden TIF-bestanden.OPMERKING: Afbeeldingen die zijn verkregen met de bestandsextensie .czi hoeven niet te worden geëxporteerd als TIF-bestanden, maar het kanaal met de celranden moet nog steeds worden geïsoleerd. Installeer de software op Windows x64- of Linux-platforms (Centos 7).OPMERKING: De software en de instructies voor de installatie zijn te vinden op https://github.com/nih-nei/REShAPE. Open de software (figuur 1). Selecteer op het tabblad Mappen de invoer- en uitvoermappen. Selecteer in de invoermap de map die de afbeeldingen bevat. Laat de software in de uitvoermap het pad automatisch wijzigen in “invoermap /Verwerkt”. U kunt ook de uitvoermap handmatig wijzigen.OPMERKING: De software itereert door alle afbeeldingen in de invoermap. Kies op het tabblad NN-segmentatieopties de volgende instellingen voor afbeeldingssegmentatie:Batchgrootte: typ een waarde van 20 in het tekstvak als een goed startpunt, maar verlaag deze als het systeem geen GPU’s (Graphics Processing Units) meer heeft.OPMERKING: De oorspronkelijke afbeelding wordt opgesplitst in kleinere tegels voor verwerking. De batchgrootte geeft aan hoeveel tegels tegelijk kunnen worden verwerkt. GPU gebruiken?: Als het systeem niet genoeg GPU-bronnen heeft, vinkt u het selectievakje Nee aan. Interne schaal: wijzig met behulp van het vervolgkeuzemenu de interne schaling van Geen in gevallen waarin de afbeeldingen niet zijn verkregen met een doelstelling van 10x of 20x. Schaal bijvoorbeeld 40x afbeeldingen naar de helft van de grootte met behulp van de 1/2-knop . De schaalaanpassingsopties die beschikbaar zijn in het vervolgkeuzemenu zijn als volgt: 5x, 2x, Geen, 1/2, 1/5.OPMERKING: De machine learning is getraind met 10x en 20x images. Het is mogelijk dat celranden niet worden herkend van afbeeldingen die bij andere vergrotingen zijn gemaakt. In dit geval verschijnen binaire afbeeldingen volledig zwart. Arti-filter: gebruik het artefactfiltertabblad om zeer heldere deeltjes (puin of kleine delen van het netvlies of bindweefsel rond de oogzenuw) te verwijderen die in de afbeelding aanwezig kunnen zijn en de segmentatie van de celrand kunnen verstoren. Er wordt standaard geen filter gebruikt. De kunstmatige filteropties in het vervolgkeuzemenu zijn als volgt: Normaal, Sterk en Zwak. Voeg op het tabblad Optie voor tegelafbeelding een waarde in het tekstvak in om de hoeveelheid overlap tussen de afbeeldingstegels op te geven door de parameter Padtegels per aan te passen. Een overlap van 100 pixels werkt meestal goed. Stem op het tabblad Opties voor uitvoerafbeelding de instellingen voor het genereren van heatmaps af:Tegelbeelden reconstrueren?: als het systeem niet over voldoende middelen beschikt voor de analyse van grote afbeeldingen, vink dan het vakje Nee aan om de software toe te staan de analyse te voltooien door afzonderlijke tegels op te slaan zonder de hele afbeelding te reconstrueren. Kleurenafbeeldingen maken: Als u heatmaps wilt genereren, selecteert u Alles in het vervolgkeuzemenu. Kies voor Kleuren een van de verschillende kleurenpaletten die beschikbaar zijn in het vervolgkeuzemenu: Thermisch, Groen, Mpl-magma, Fase, Vuur, Jet, Cyaan heet. Sla de afbeeldingen bij Afbeeldingsindeling op als TIF of PNG door een van de opties op het tabblad te selecteren. Met betrekking tot de functie Handmatige limieten gebruiken? vinkt u het selectievakje Nee aan om de software de minimum- en maximumwaarden te laten gebruiken die in elke afbeelding zijn gedetecteerd. Vink het selectievakje Ja aan om het bereik van waarden voor elke vorm metrische heatmap handmatig aan te passen en klik op de knop Limieten instellen om bereiken voor de afzonderlijke parameters te kiezen door waarden in de tekstvakken in te voegen. Nadat u de interessante waarden hebt gewijzigd, klikt u op Opslaan. Klik op Standaardwaarden laden om alle limieten opnieuw in te stellen.OPMERKING: Gebruik handmatige limieten als heatmaps van meerdere afbeeldingen moeten worden vergeleken, bijvoorbeeld bij het vergelijken van de effecten van verschillende verbindingen op de celvorm. Op deze manier wordt hetzelfde waardenbereik gebruikt. De set waarden die handmatig moet worden ingevoerd, varieert afhankelijk van het type monster. Het wordt aanbevolen om een paar iteraties uit te voeren om het optimale bereik te kiezen. Selecteer op het tabblad Beperkingen voor celgrootte voor analyse een drempelwaarde voor celgrootte voor de analyse:Voeg in Onder celgrootte in het tekstvak de grootte in van de kleinste cel die in de analyse moet worden opgenomen. Voeg in Bovenste celgrootte in het tekstvak de grootte in van de grootste cel die in de analyse moet worden opgenomen.OPMERKING: De eenheid van celgrootte verandert van pixels in micrometers in het kwadraat, afhankelijk van de optie die is gekozen op het tabblad Geautomatiseerde eenheidsconversie . Kies op het tabblad Geautomatiseerde eenheidsconversie de voorkeurseenheid voor de analyse:Schakel in Pixels converteren naar echte eenheden? het selectievakje Nee in om de analyse in pixeleenheden uit te voeren. Schakel het selectievakje Ja in om de analyse in micrometers uit te voeren. Voer bij Lengte van schaalbalk (Pixels) de pixelwaarde in het tekstvak in. Voer bij Lengte van schaalbalk (Micron) in het tekstvak de overeenkomstige afstand in micrometers in. Om de analyse te starten, drukt u op Go For It.OPMERKING: De software kan ook de levensvatbaarheid van cellen meten wanneer de cellen zijn gekleurd met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) en propidiumjodide (tabblad CZI-opties ), maar dit is niet van toepassing op RPE flatmounts. Figuur 1: REShAPE grafische gebruikersinterface. De GUI heeft verschillende tabbladen voor het selecteren van de werkmappen (tabblad Mappen ), het wijzigen van de segmentatieopties (tabblad NN-segmentatieopties en betegelde afbeeldingsopties ), het opgeven van de parameters voor analyse (tabbladen Celgroottebeperkingen voor analyse en geautomatiseerde eenheidsconversie ) en voor het genereren van heatmaps (tabblad Opties voor uitvoerafbeeldingen ). Afkorting: GUI = grafische gebruikersinterface. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.