Эффективная и последовательная генерация пигментных эпителиев сетчатки / плоских гор сосудистой оболочки из глаз человека для гистологического анализа

Трупные человеческие глобусы были получены из Advanced Sight Network (Бирмингем, Алабама). Работа, выполненная на трупной ткани, освобождается Советом по институциональному обзору NIH от комитета по этике исследований. 1. Доставка глазного глобуса После энуклеации отправьте свежие глазные шары в контейнер, наполненный ледяным DPBS 1x с Ca2+ и Mg2+.ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше рассечь глаз в течение 24 ч после энуклеации. Морфология RPE не изменяется в течение этого временного окна. 2. Подготовка силиконовой формы Вырежьте дно 20 мм из трубки круглого дна диаметром 25 мм. Поместите его у основания квадратной весовой лодки (81 мм x 81 мм x 25 мм). Смешайте два компонента silicon Elastomer Kit в соотношении 10:1, обращая внимание на то, чтобы не засорять воздух. Вылейте смесь в весовую лодку, содержащую сферический кусок трубки с круглым дном. Отверните силикон при комнатной температуре на ночь. Снимите весовую лодку и трубку с круглым дном из отвержденной силиконовой формы. 3. Рассечение РПЭ Очистите склеру свежего глаза, глобус мышц и соединительной ткани. Прикрепите глаз к силиконовой форме с помощью игл 27 г, продетых через склеру. Заполните полость формы DPBS 1x с Ca2+ и Mg2+.ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание, чтобы не нарушить глазную камеру. Иглы должны проходить только через склеру. Используйте шприц 1 мл и иглу 21 г для введения ~ 400 мкл раствора D-маннита 1 700 мОсм в стекловидное тело. Вставьте иглу через pars plana, чтобы избежать прокалывания передней камеры глаза. Оставьте глаз при комнатной температуре на ~45 мин. Разрежьте переднюю камеру на уровне pars plana с помощью тонких ножниц и щипцов. Заполните заднюю камеру глаза DPBS 1x с Ca2+ и Mg2+. Под стереомикроскопом локализуют макулу (желтое пятно на сетчатке). Если доступен хирургический резак для стекловидного тела, удалите стекловидное тело и замените его DPBS 1x с Ca2+ и Mg2+. Как вариант, попробуйте поднять стекловидное тело щипцами и разрезать его тонкими ножницами. Обращая внимание на сохранение макулярной области, разрезайте глаз на квадранты: носовой, височный, верхний и нижний. Удалите иглы, если они мешают. Перенесите заднюю камеру глаза в 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую DPBS 1x с Ca2+ и Mg2+. Перед удалением сетчатки отметьте лепесток, содержащий макулу, сделав небольшой разрез (V-образный) в цилиарном крае. Поднимите и срежьте все стекловидное тело, которое лежит на сетчатке. Осторожно поднимите сетчатку с нескольких сторон с помощью изогнутого шпателя или пары щипцов, чтобы проверить, отделилась ли сетчатка от RPE, и позволить некоторой жидкости циркулировать между двумя слоями.ПРИМЕЧАНИЕ: Сетчатка по-прежнему будет прикреплена на самой периферии (цилиарные края) и на зрительном нерве. Отрежьте сетчатку от цилиарных краев во всех лепестках, следя за тем, чтобы не поцарапать РПЭ. Поместите ткань в 4% PFA и инкубируйте в течение ~ 1 ч. Стирка 3x с DPBS 1x с Ca2+ и Mg2+. Переложите ткань в контейнер, наполненный DPBS 1x с Ca2+ и Mg2+ и храните его при 4 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент сетчатка прикреплена только к зрительному нерву. Это точка паузы в этом эксперименте. Перенесите образец на чашку Петри толщиной 100 мм, содержащую DPBS 1x с Ca2+ и Mg2+. Выбивайте головку зрительного нерва с помощью биопсийного пунша 1,5 мм и соберите сетчатку. Храните нервную сетчатку в DPBS 1x с Ca2+ и Mg2+ при 4 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем пробивать головку зрительного нерва, убедитесь, что зрительный нерв как можно больше разрезает на склеральной стороне. Это повысит точность удара. Выбивание зрительного нерва после того, как плоское крепление зафиксировано в 4% PFA, уменьшает повреждение клеток RPE, расположенных вокруг зрительного нерва. Удалите склеру из RPE / сосудистой оболочки, осторожно подняв слой RPE / сосудистой оболочки с периферии и разрезав сосуды сосудистой оболочки и соединительную ткань, которые находятся между склерой и RPE с помощью пружинных ножниц Vannas. Как только RPE / сосудистая оболочка будет полностью отделена от склеры, соберите слой RPE / сосудистой оболочки. Переложите ткань в контейнер, наполненный DPBS 1x с Ca2+ и Mg2+ , и храните его при 4°C.ПРИМЕЧАНИЕ: В это время эксперимент можно приостановить. 4. Окрашивание Перенесите RPE/сосудистую оболочку в одну лунку из 6-луночной пластины. Блокируют и пермеабилизируют образец в DPBS 1x с Ca2+ и Mg2+ с 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA), 0,5% Tween 20 и 0,5% Triton X-100 в течение 1 ч при комнатной температуре. Инкубируют образец с фаллоидином, сопряженным с флуорофором 647 в разведении 1:250 в DPBS 1x с Ca2+ и Mg2+ с 1% BSA, 0,5% Tween 20 и 0,5% Triton X-100 в течение 1 ч при комнатной температуре. Стирайте 3x в DPBS 1x с Ca2+ и Mg2+. Перенесите образец RPE/сосудистой оболочки на стеклянный слайд размером 50 мм x 75 мм и сгладите его. Разрежьте каждый «лепесток» на две части, чтобы образец был более плоским. Обратите внимание на макулу. Нарисуйте контур плоского крепления гидрофобным пером. Для гашения автофлуоресценции липофусцина добавляют 500 мкл раствора автофлуоресцентного гасителя, разбавленного до 1:20 в 70% этаноле и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 мин. Тщательно вымойте (не менее 3x) в DPBS 1x с Ca2+ и Mg2+. Извлеките DPBS и добавьте монтажный носитель. Поместите накладное стекло на плоское крепление и запечатайте лаком для ногтей. Изобразите плоское крепление с помощью флуоресцентного микроскопа (предпочтительно с использованием объектива 10x или 20x). 5. Анализ RESHAPE ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку алгоритм на основе REShAPE AI был обучен на изображениях 10x и 20x, поэтому настоятельно рекомендуется использовать объектив 10x или 20x при визуализации. Если нет, изображения необходимо будет соответствующим образом масштабировать. Если изображения получены с помощью более чем одного флуоресцентного канала, изолируйте канал, используемый для получения границ клеток. Экспортируйте изображения в виде 16-битных TIF-файлов в оттенках серого.ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения, полученные с расширением .czi, не нужно экспортировать как файлы TIF, но канал, содержащий границы ячеек, по-прежнему необходимо изолировать. Установите программное обеспечение на платформах Windows x64 или Linux (Centos 7).ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение и инструкции по установке можно найти на https://github.com/nih-nei/REShAPE. Откройте программное обеспечение (рисунок 1). На вкладке Каталоги выберите входные и выходные папки. Во входном каталоге выберите папку, содержащую изображения. В выходном каталоге пусть программное обеспечение автоматически изменит путь на “input directory/Processed”. Кроме того, можно изменить выходной каталог вручную.ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение будет перебирать все изображения, содержащиеся во входной папке. На вкладке Параметры сегментации NN выберите следующие параметры сегментации изображений:Размер пакета: введите значение 20 в текстовом поле в качестве хорошей отправной точки, но уменьшите его, если в системе закончатся графические процессоры (GPU).ПРИМЕЧАНИЕ: Исходное изображение разделено на более мелкие плитки для обработки. Размер пакета определяет, сколько плиток может быть обработано одновременно. Использовать GPU?: Если в системе недостаточно ресурсов ГРАФИЧЕСКОГО ПРОЦЕССОРА, установите флажок Нет. Внутреннее масштабирование: используя раскрывающееся меню, измените внутреннее масштабирование с Нет в тех случаях, когда изображения не были получены с целью 10x или 20x. Например, уменьшите масштаб изображений в 40 раз до половины размера с помощью кнопки 1/2 . Параметры масштабирования, доступные в раскрывающемся меню: 5x, 2x, None, 1/2, 1/5.ПРИМЕЧАНИЕ: Машинное обучение было обучено с 10x и 20x изображениями. Он может не распознавать границы клеток по изображениям, сделанным при других увеличениях. В этом случае двоичные изображения будут выглядеть полностью черными. Arti Filter: Используйте вкладку фильтра артефактов для удаления очень ярких частиц (обломков или небольших частей сетчатки или соединительной ткани вокруг зрительного нерва), которые могут присутствовать на изображении и могут мешать сегментации границ клеток. По умолчанию фильтр не используется. Параметры искусственного фильтра в раскрывающемся меню следующие: Обычный, Сильный и Слабый. На вкладке Параметр мозаичного изображения вставьте в текстовое поле значение, чтобы указать степень перекрытия между плитками изображения, настроив параметр Pad Tiles By . Перекрытие в 100 пикселей обычно работает хорошо. На вкладке Параметры выходного рисунка настройте параметры для создания тепловой карты:Reconstruct Tiled Images?: если в системе недостаточно ресурсов для анализа больших изображений, установите флажок Нет , чтобы позволить программному обеспечению завершить анализ, сохранив отдельные плитки без реконструкции всего изображения. Создание цветных изображений: чтобы создать тепловые карты, выберите Все в раскрывающемся меню. Для параметра «Раскраска» выберите любую из различных цветовых палитр, доступных в раскрывающемся меню: «Термальный», «Зеленый», «Mpl-магма», «Фаза», «Огонь», «Струя», «Голубой горячий». В поле Формат изображения сохраните изображения в формате TIF или PNG, выбрав один из параметров на вкладке. Что касается функции Use Manual Limits? , установите флажок Нет , чтобы программное обеспечение использовало минимальные и максимальные значения, обнаруженные в каждом изображении. Установите флажок Да , чтобы вручную настроить диапазон значений для каждой метрической тепловой карты фигуры, и нажмите кнопку Установить ограничения , чтобы выбрать диапазоны для отдельных параметров, вставив значения в текстовые поля. После изменения интересующих значений нажмите кнопку Сохранить. Нажмите Загрузить значения по умолчанию, чтобы сбросить все ограничения.ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ручные ограничения, если необходимо сравнивать тепловые карты из нескольких изображений, например, при сравнении влияния различных соединений на форму ячейки. Таким образом, используется один и тот же диапазон значений. Набор значений, вводимых вручную, зависит от типа образца. Рекомендуется выполнить несколько итераций, чтобы выбрать оптимальный диапазон. На вкладке Ограничения размера ячейки для анализа выберите пороговое значение размера ячейки для анализа.В поле Нижний размер ячейки вставьте в текстовое поле размер наименьшей ячейки, которая будет включена в анализ. В поле Верхний размер ячейки вставьте в текстовое поле размер самой большой ячейки, которая будет включена в анализ.ПРИМЕЧАНИЕ: Единица измерения размера ячейки изменяется от пикселей до микрометров в квадрате в зависимости от опции, выбранной на вкладке Автоматическое преобразование единиц измерения. На вкладке Автоматическое преобразование единиц выберите предпочтительную единицу измерения для анализа:В разделе Преобразовать пиксели в реальные единицы? установите флажок Нет , чтобы выполнить анализ в пиксельных единицах. Установите флажок Да , чтобы запустить анализ в микрометрах. В поле Длина шкалы (пиксели) введите значение пикселя в текстовом поле. В поле Длина шкалы (микрон) введите в текстовое поле соответствующее расстояние в микрометрах. Чтобы начать анализ, нажмите кнопку Go For It.ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение также может измерять жизнеспособность клеток, когда клетки окрашены 4′,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) и йодидом пропидия (вкладка параметров CZI ), но это не относится к плоским креплениям RPE. Рисунок 1: Графический интерфейс пользователя REShAPE. Графический интерфейс пользователя имеет различные вкладки для выбора рабочих каталогов (вкладка «Каталоги »), изменения параметров сегментации (вкладки «Параметры сегментации NN» и «Параметры мозаичного изображения »), указания параметров анализа (вкладки «Ограничения размера ячеек для анализа » и «Автоматическое преобразование единиц измерения») и для создания тепловой карты (вкладка «Параметры выходной графики »). Аббревиатура: GUI = графический интерфейс пользователя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.