ייצור יעיל ועקבי של אפיתל פיגמנט רשתית/כורואיד שטוח מעיני אדם לניתוח היסטולוגי
Summary
אנו מתארים שיטה להפרדה יעילה של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) מהרשתית בעיניים אנושיות ויצירת שטוחים שלמים של RPE/כורואידים לצורך ניתוחים היסטולוגיים ומורפומטריים של ה-RPE.
Abstract
אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) והרשתית הן רקמות המחוברות מבחינה תפקודית ומבנית הפועלות יחד כדי לווסת את תפיסת האור והראייה. חלבונים על פני השטח האפיקליים של RPE קשורים קשר הדוק לחלבונים על פני השטח של המקטע החיצוני של הפוטורצפטור, מה שמקשה על הפרדה עקבית בין ה-RPE לבין הפוטורצפטורים/הרשתית. פיתחנו שיטה להפרדה יעילה של הרשתית מה-RPE של עיניים אנושיות כדי ליצור RPE/כורואיד ורשתית שטוחים שלמים לצורך אנליזה תאית נפרדת של הפוטורצפטורים ותאי ה-RPE. הזרקה תוך-גופית של תמיסה בעלת אוסמולריות גבוהה של D-מניטול, סוכר שאינו מועבר על ידי ה-RPE, גרמה להפרדת ה-RPE והרשתית על פני כל התא האחורי מבלי לגרום נזק לצמתים של תאי ה-RPE. לא נצפו טלאי RPE מחוברים לרשתית. תיוג פאלוידין של אקטין הראה שימור צורת RPE ואיפשר ניתוח מורפומטרי של האפיתל כולו. תוכנה מבוססת בינה מלאכותית (AI) פותחה כדי לזהות ולפלח במדויק את גבולות תאי ה-RPE ולכמת 30 מדדי צורה שונים. שיטת דיסקציה זו ניתנת לשחזור וניתן להרחיב אותה בקלות למודלים אחרים של בעלי חיים.
Introduction
אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) והרשתית העצבית קשורים זה בזה בחוזקה בגלל התלות הפיזיולוגית החזקה של הפוטורצפטורים ב-RPE. במהלך הדיסקציה, ההפרדה המכנית של הרשתית העצבית מה-RPE גורמת לקרע של תאי ה-RPE, כאשר החלקים האפיקליים של ה-RPE נותרים מחוברים למקטעים החיצוניים של הפוטורצפטורים ברשתית. היקף ההידבקות ברשתית RPE הוא כה גדול, עד שכמות הפיגמנט שנותרה על הרשתית לאחר ההפרדה משמשת לכימות עוצמת הידבקות הרשתית1. באופן ספציפי, צמתים הדוקים RPE ומבנה האקטין המחבר ביניהם, הממוקמים בצד האפיקלי, מתנתקים במהלך הפרדה מכנית. לכן, צביעת משטחי RPE עבור גבולות התא גורמת לחד-שכבתי מטושטש שבו לתאים רבים יש גבולות חסרים. השפעה זו מחריפה כאשר הרקמה קבועה עם paraformaldehyde (PFA) לפני דיסקציה, כמו חלבונים להיות crosslinked.
מחקרים על מתן תרופות תוך-ורידיות הראו כי זריקות של תמיסות היפרוסמוטיות בתא האחורי גורמות לניתוק רשתית 2,3. בניסויים אלה, 50 μL של פתרונות שונים, החל מ-1,000 mOsm ועד 2,400 mOsm, שהוזרקו באמצע הזגוגית, גרמו לניתוק הרשתית תוך דקות. יש לציין כי גם לאחר חשיפות ארוכות לתמיסות בעלות אוסמולריות גבוהה, הצמתים ההדוקים של RPE הופיעו שלמים בתמונות מיקרוסקופיות של אלקטרונים של ארנב וקוף3. בעקבות אסטרטגיה דומה, הזרקנו לתוך הזגוגית האמצעית תמיסה היפרוסמוטית של D-מניטול כדי לגרום לניתוק יעיל של הרשתית לפני ביצוע דיסקציה של RPE. מכיוון שמניטול D אינו מועבר על ידי RPE4, נשמר ריכוז תוך-ורידי גבוה, היוצר שיפוע אוסמוטי. ההפרדה היעילה של ה-RPE והרשתית על פני כל התא האחורי מבטיחה את שימור הצמתים הסלולריים של ה-RPE ומאפשרת לחקור את המורפומטריה של RPE על כל המשטח השטוח. בנוסף, פיתחנו תוכנה מבוססת בינה מלאכותית (AI) שמזהה ומפלחת גבולות תא RPE המסומנים באופן פלואורסצנטי, מכמתת 30 מדדי צורה שונים ומייצרת מפות חום של כל מדד להדמיה 5,6.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההפרדה העקבית והיעילה של RPE ורשתיות אנושיות יכולה להיות מושגת באמצעות פרוטוקול זה. שיטה זו מאפשרת לחקור הבדלים אזוריים בצורת RPE על פני כל הרשתיות האנושיות5. שלב מכריע בפרוטוקול הוא ההפרדה הפיזית של ה-RPE והרשתית. אם שתי הרקמות אינן מנותקות לחלוטין באזורים מסוימים, יש להרים בעדינות את הרשתית, תוך הקפדה שלא לשבור את הרקמות. ניתוח REShAPE של flatmounts גדולים עשוי לדרוש שימוש במערכות עם משאבי RAM ניכרים. במקרה זה, ניתן להשבית את ההרכבה מחדש של התמונה כולה כדי לאפשר לתוכנה לסיים בהצלחה את הניתוח למרות היעדר משאבי עיבוד.
המגבלה העיקרית של השימוש ב- REShAPE כדי לפלח שטוחות RPE אנושיות היא שאלגוריתם הבינה המלאכותית אומן בעיקר על תמונות של RPE המושרה שמקורו בתאי גזע פלוריפוטנטיים. כתוצאה מכך, הפילוח של שטוחי RPE אנושיים הוא פחות מדויק. תאי RPE מתורמים זקנים מכילים כמות גדולה של ליפופוסצין7, והספקטרום הרחב של האוטופלואורסצנציה שלו מפריע לסגמנטציה של גבול התא. בעתיד, תמונות נוספות של שטוחות RPE ישמשו לשיפור סגמנטציה של גבולות התא בדגימה מסוג זה. למרות מגבלה זו, REShAPE הוכשרה במיוחד לזהות ולפלח גבולות תאי RPE ומתפקדת טוב יותר משיטות קיימות אחרות, כגון וורונוי8 וסגמנטציה של תאי RPE CellProfiler9 .
יתר על כן, בהשוואה לסגמנטציה ידנית 10, REShAPE מספק את היתרון של ניתוח תמונות גדולות במהירות (~ 130,000 פיקסלים x130,000 פיקסלים נבדקו). לסיכום, שיטת דיסקציה זו ניתנת לשחזור וניתן להרחיב אותה בקלות למודלים אחרים של בעלי חיים. בנוסף, התוכנה יכולה לשמש לחקר צורת RPE בעיניים שטוחות או במודלים של תרביות תאים כדי לבחון את ההשפעה של טיפולים מסוימים. לבסוף, הרבגוניות של REShAPE הופכת אותו לישים באופן נרחב לניתוח של סוגים אחרים של תאי אפיתל.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לליבת ההיסטולוגיה של המכון הלאומי לעיניים (NEI) על השימוש ב-Zeiss Axio Scan.Z1. אנו מודים גם לתורמים, למשפחותיהם, לרשת הראייה המתקדמת ולמכון עין האריות על נדיבותם. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות NEI IRP (מענק מספר ZIA EY000533-04).
Materials
| Biopsy punch 1.5 mm | Acuderm Inc. | P1525 | |
| Bovine albumin | MP Biomedicals | 160069 | |
| Coverglass 50 x 75 mm, #1.5 thickness | Brain Research Laboratories | 5075-1.5D | |
| Curved spatula | Katena | K3-6600 | |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
| DPBS 1x with Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 14040-133 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14558-11 | |
| Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| Microscope slides 50 x 75 x 1.2 mm | Brain Research Laboratories | 5075 | |
| Needles 21 G x 1-1/2" hypodermic | Becton Dickinson (BD) | 305167 | |
| Needles 27 G x 1-1/4" hypodermic | Becton Dickinson (BD) | 305136 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Petri dish 100 mm | Corning | 430167 | |
| Phalloidin-iFluor 647 | Abcam | ab176759 | |
| Razor blades | PAL (Personna) | 62-0177 | |
| Round bottom tubes 50 mL | Newegg | 9SIA4SR9M88854 | |
| Silicon Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 4019862 | |
| Square weighing boat (81 mm x 81 mm x 25 mm) | Sigma | W2876 | |
| Surgical Vitrectomy System | BD Visitrec | 585100 | optional |
| Syringe 1 mL | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| TrueBlack | Biotium | 23007 | autofluorescence quencher |
| Tween 20 | Affymetrix | 20605 | |
| Vannas Spring Scissors – 3 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-10 |
References
- Endo, E. G., Yao, X. Y., Marmor, M. F. Pigment adherence as a measure of retinal adhesion: Dependence on temperature. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (9), 1390-1396 (1988).
- Marmor, M. F. Retinal detachment from hyperosmotic intravitreal injection. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 18 (12), 1237-1244 (1979).
- Marmor, M. F., Martin, L. J., Tharpe, S. Osmotically induced retinal detachment in the rabbit and primate. Electron microscopy of the pigment epithelium. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 19 (9), 1016-1029 (1980).
- Ban, Y., Rizzolo, L. A culture model of development reveals multiple properties of RPE tight junctions. Molecular Vision. 3, 18 (1997).
- Ortolan, D., et al. Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (19), 2117553119 (2022).
- Schaub, N. J., et al. Deep learning predicts function of live retinal pigment epithelium from quantitative microscopy. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 1010-1023 (2020).
- Beatty, S., Koh, H. -. H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).
- Liu, Z., Kocaoglu, O. P., Miller, D. T. 3D imaging of retinal pigment epithelial cells in the living human retina. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (9), 533-543 (2016).
- Bhatia, S. K., et al. Analysis of RPE morphometry in human eyes. Molecular Vision. 22, 898-916 (2016).
- vonder Emde, L., et al. Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes. Translational Vision Science & Technology. 11 (8), 19 (2022).
