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Biology

Un modello 3D di midollo osseo umano per studiare le dinamiche e le interazioni tra cellule residenti in contesti fisiologici o tumorali

Published: December 16, 2022
doi:
10.3791/64736
, , , , , , , , , ,
1Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, 2Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, 3Université de Lyon, 4Centre Léon Bérard, 5Department of Experimental and Clinical Biomedical Sciences Mario Serio,Università degli Studi di Firenze

Summary

Qui, descriviamo un sistema microfisiologico standardizzato e facile da implementare che riflette la complessità della struttura in vivo del midollo osseo umano, fornendo un modello pertinente per studiare con precisione una vasta gamma di eventi normali e patologici.

Abstract

La nicchia midollare è un ecosistema complesso che è essenziale per mantenere l’omeostasi per le cellule residenti. Infatti, il midollo osseo, che comprende una matrice extracellulare complessa e vari tipi di cellule, come cellule staminali mesenchimali, osteoblasti e cellule endoteliali, è profondamente coinvolto nella regolazione delle cellule staminali ematopoietiche attraverso interazioni dirette cellula-cellula, nonché nella produzione di citochine. Per imitare da vicino questa struttura in vivo e condurre esperimenti che riflettano le risposte del midollo osseo umano, sono stati creati diversi modelli 3D basati su biomateriali, basandosi principalmente su cellule stromali primarie. Qui viene descritto un protocollo per ottenere un sistema minimale e standardizzato che è facile da configurare e fornisce caratteristiche della struttura simile al midollo osseo, che combina diverse popolazioni cellulari comprese le cellule endoteliali e riflette l’eterogeneità del tessuto midollare osseo in vivo . Questa struttura 3D simile al midollo osseo, assemblata utilizzando particelle a base di fosfato di calcio e linee cellulari umane, rappresentative del microambiente del midollo osseo, consente il monitoraggio di un’ampia varietà di processi biologici combinando o sostituendo diverse popolazioni cellulari primarie all’interno del sistema. Le strutture 3D finali possono quindi essere raccolte per l’analisi delle immagini dopo la fissazione, l’incorporazione di paraffina e la colorazione istologica / immunoistochimica per la localizzazione cellulare all’interno del sistema, o dissociate per raccogliere ogni componente cellulare per la caratterizzazione molecolare o funzionale.

Introduction

Il midollo osseo (BM) si trova all’interno di entrambe le cavità centrali delle ossa assiali e lunghe e delle ossa piatte trabecolari e contiene una varietà di componenti cellulari e non cellulari distinti. A livello strutturale, è costituito da isole di tessuto ematopoietico (chiamate anche “ematoni”)1,2 e cellule adipose circondate da seni vascolari intervallati all’interno dell’osso trabecolare3. Nelle ossa lunghe e piatte, l’afflusso di sangue all’osso e al midollo osseo sono interconnessi attraverso una rete endostale di vasi4. Nascosto in questa solida rete protettiva, il BM ospita cellule molto immature immerse in uno stroma spugnoso e costituisce la sede per la differenziazione delle cellule staminali mesenchimali residenti (MSC) e delle cellule staminali ematopoietiche (HSCs)5. Infatti, oltre al rinnovamento dei tessuti ossei attraverso la produzione di osteoblasti, una delle principali funzioni note del BM risiede nello sviluppo dell’ematopoiesi6.

Il tessuto ematopoietico BM comprende una varietà di tipi di cellule, vale a dire HSC, precursori e cellule del sangue più differenziate come linfociti, neutrofili, eritrociti, granulociti, monociti e trombociti7. Le cellule ematopoietiche non sono disposte casualmente nello spazio BM ma mostrano una particolare organizzazione all’interno delle nicchie ematopoietiche, che comprendono molti tipi cellulari di diversa origine (osteoblasti, osteoclasti, MSCs, adipociti, endotelio sinusoidale e cellule stromali perivascolari, cellule immunitarie, cellule nervose e distinte cellule ematopoietiche mature), formando una struttura complessa per garantire la normale emopoiesi8 . Le funzioni biologiche della nicchia ematopoietica comprendono la regolazione della sopravvivenza delle HSC, l’adesione, la quiescenza, l’homing e il differenziamento attraverso diversi meccanismi (interazioni cellula-cellula e cellula-matrice, produzione di fattori solubili, ipossia) in risposta a molteplici stress fisiologici o non fisiologici 3,6. Sebbene queste nicchie ematopoietiche fossero inizialmente percepite come entità omogenee, i progressi tecnologici come le analisi a singola cellula e di imaging hanno progressivamente rivelato la loro complessità, dinamica e proprietà adattive 9,10,11.

La necessità cruciale di sostituire e ridurre l’uso di animali per decifrare i processi fisiologici e patologici umani porta a nuove opportunità e sfide11,12. Tra gli strumenti in vitro recentemente descritti, sono stati proposti modelli tridimensionali (3D) che imitano il BM umano in vivo meglio delle classiche colture bidimensionali (2D) 13,14,15,16,17. La modellazione 3D sembra quindi essere un approccio promettente per osservare le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice, più vicine a quelle che si verificano in vivo. Utilizzando una varietà di questi modelli, alcuni team hanno dimostrato la sopravvivenza e la proliferazione delle HSC18,19. Sono disponibili diversi modelli 3D, l’approccio più comune è l’uso di biomateriali 3D basati su scaffold come idrogel, colloidi o collageni, associati alle MSC che sfruttano le loro capacità di differenziazione della linea osteoblastica20,21,22. Tuttavia, non è stato raggiunto alcun consenso globale per soddisfare tutti i requisiti per gli studi sulle cellule umane in modo user-friendly e standardizzato23, soprattutto perché questi attuali sistemi 3D si basano principalmente su cellule stromali primarie e quindi soffrono di accesso limitato a campioni primari, disponibilità di tessuti ed eterogeneità.

Inoltre, dovrebbe essere introdotto il compartimento delle cellule endoteliali poiché queste cellule rappresentano una componente importante delle interazioni cellula-cellula e sono coinvolte nel destino delle cellule staminali e nello sviluppo della malattia BM, sia nella leucemia24 che nelle metastasi25. Abbiamo precedentemente riportato che l’aggiunta di elementi patologici in un modello standardizzato di midollo osseo 3D umano ricapitola le caratteristiche osservate nei campioni di pazienti come le alterazioni della matrice extracellulare (ECM)26. Per comprendere meglio le dinamiche e le interazioni tra il microambiente BM umano e le cellule residenti, forniamo un protocollo dettagliato per un sistema user-friendly e standardizzato per costruire una struttura minima, ben organizzata, simile a BM. Questo sistema è composto da tre tipi di cellule del midollo osseo umano: cellule endoteliali e cellule stromali, che rappresentano il microambiente, e HSC. Utilizzando perline specifiche come impalcatura e mezzo di differenziazione osteoblastica, la struttura 3D ottenuta imiterà la nicchia midollare umana, consentendo uno studio pratico del midollo osseo umano.

Protocol

NOTA: Per preparare la struttura della spina dorsale simile al midollo osseo, questo protocollo si basa sulla combinazione di perline con cellule endoteliali HMEC-1 e cellule stromali HS27A su perle di fosfato di calcio bifasico (BCP). Le perle BCP fungeranno da impalcatura permettendo, con un mezzo specifico, la modellazione strutturale 3D. 1. Preparazione e sterilizzazione delle perline Pesare 35-40 mg di perle di BCP (HA/β-TCP 60/40; 45-75 μm) per ciascun inserto (piccolo, cilindrico, piatto di plastica con una membrana di policarbonato nella parte inferiore) in un tubo da 1,5 mL (vedi Tabella dei materiali). Dopo aver pesato le perline, praticare un piccolo foro con un ago pulito attraverso la parte superiore del tubo da 1,5 mL per evitare che il coperchio si apra durante il ciclo dell’autoclave (121 °C per 60 minuti) e posizionare i tubi in posizione verticale in una scatola sterile chiusa. 2.3D inserire la preparazione sotto un cappuccio sterile Inserire inserti di coltura cellulare sterile in policarbonato all’interno dei pozzetti di una piastra a 6 pozzetti. Versare le sfere sterili di BCP da un tubo da 1,5 ml nell’inserto. Lavare accuratamente le perle facendo gocciolare 350 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) all’interno dell’inserto, quindi aggiungere 4,5 ml di 1x PBS nel pozzetto. Rimuovere ed eliminare il PBS utilizzando il vuoto o una pipetta da 5 ml posizionando la punta in un angolo del pozzetto. Ripetere la fase di lavaggio due volte. Una volta lavate le perline, utilizzare 1x PBS integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS) per bloccare il sistema. Aggiungere con cautela 350 μL della soluzione bloccante all’inserto e 4,5 mL nel pozzetto e posizionare l’intera piastra in un incubatore a 37 °C, 5% di CO2 durante la notte.NOTA: i passaggi 2.1 e 2.2 aiutano a ridurre al minimo il rilascio di ioni dalle sfere BCP prima della semina cellulare. 3. Raccolta di linee cellulari e manutenzione 3D NOTA: Dopo questa fase di incubazione, le cellule microambientali vengono aggiunte per formare la spina dorsale della struttura 3D. Questo sistema si basa sull’utilizzo di HMEC-1, cellule endoteliali microvascolari umane immortalate con grande antigene T da SV40, e HS27A, cellule stromali del midollo osseo umano immortalate con papillomavirus umano, grazie alla loro capacità di formare una solida struttura BM-like e alla loro compatibilità con l’inclusione di cellule endoteliali. Prima di aggiungere celle al sistema, preparare i seguenti mezzi di incubazione:Per 50 ml di Osteo Differentiation Medium (ODM) completo, mescolare 45 mL di terreno di aquila modificato di Dulbecco (DMEM) + 5 mL di FBS + 0,5 mL di penicillina-streptomicina + 8 × 10-4 mg/L di desametasone + 2,16 g/L di beta-glicerofosfato + 44 mg/L di acido ascorbico. Per 50 mL di terreno HMEC-1 completo, mescolare 45 mL di MCDB 131 + 5 mL di FBS + 0,5 mL di penicillina-streptomicina + 1% di sostituto della glutammina + 1 mg/L di idrocortisone + 10 μg/L di EGF. Rimuovere la soluzione di blocco dal sistema. Mescolare 1 × 106 cellule HMEC-1 (che rappresentano il compartimento vascolare) e 2 × 106 cellule HS27A (che rappresentano il compartimento cellulare mesenchimale delle cellule) in una provetta da 15 ml e centrifugare per 5 minuti a 1.575 × g a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e aggiungere 175 μL di terreno HMEC-1 (terreno specifico per la crescita delle cellule HMEC-1) con 175 μL di ODM (terreno specifico per l’osteodifferenziazione HS27A). Versare 350 μL di questa sospensione contenente 3 × 106 celle totali all’interno di ciascun inserto. Quindi, versare 4,5 ml del mezzo combinato (2,25 ml di mezzo HMEC-1 + 2,25 ml di ODM) senza cellule nei pozzetti della piastra. Aspirare delicatamente ed erogare la miscela più volte con una micropipetta da 1 mL per omogeneizzare le cellule e le perle di BCP all’interno dell’inserto. Assegnare l’intero mix per depositarsi sul fondo dell’inserto.NOTA: Si consiglia una preparazione di miscela con un volume morto se vengono coltivati più inserti. Ad esempio, se quattro inserti sono coltivati, preparare sempre il volume richiesto per cinque inserti. Una volta omogeneizzate le cellule endoteliali e mesenchimali all’interno dell’inserto, tenere la piastra a 6 pozzetti all’interno di un incubatore a 37 °C, 5% CO2 per 3 settimane. Cambiare il mezzo all’interno dell’inserto e del pozzetto 2 volte alla settimana rimuovendo con attenzione il mezzo dall’inserto utilizzando una micropipetta da 1 mL e posizionando la punta sulla parete interna dell’inserto per evitare di disturbare l’angolo dell’inserto.NOTA: Il surnatante recuperato può essere conservato a -80 °C in qualsiasi fase per una successiva quantificazione delle proteine. 4. Aggiunta di celle di interesse nel sistema NOTA: Dopo 3 settimane di coltivazione HMEC-1 e HS27A, l’osteodifferenziazione delle cellule HS27A ha permesso la rigidificazione del sistema. In questa fase, aggiungere cellule ematologiche di interesse (il numero di cellule aggiunte può variare da 1 × 104 a 1 × 106) all’interno dell’inserto. Le cellule aggiunte erano cellule TF1 trasfettate con oncogene BCR-ABL e cellule CD34+ mononucleate primarie provenienti da pazienti con leucemia mieloide acuta o da donatori sani. Cambia la composizione del mezzo in questa fase, poiché il composto ODM è tossico per le cellule ematologiche e non è necessario continuare ad aggiungerlo una volta eseguita la rigidificazione del sistema. Ad esempio, per supportare il mantenimento ematopoietico, sostituire il mezzo ODM con RPMI completo per linee cellulari ematopoietiche (RPMI integrato con il 10% di FBS e l’1% di penicillina-streptomicina) o IMDM per le cellule ematopoietiche primarie. Preparare un batch di mezzo HMEC-1 completo al 50% e mezzo RPMI/IMDM completo al 50% per le modifiche settimanali del mezzo 3D (due volte). Risospendere le cellule ematologiche di interesse in questo mezzo combinato e aggiungerlo all’interno dell’inserto. Se è necessario un protocollo di trattamento farmacologico, attendere 24 ore dopo aver aggiunto le cellule di interesse prima del trattamento, dando loro il tempo di aderire alla struttura ossea. Adattare il periodo di coltura cellulare 3D in base alle esigenze. Aggiornare il mezzo (50% HMEC-1 supporto completo + 50% RPMI mezzo completo) due volte a settimana.NOTA: Nel corso della coltura cellulare 3D, alcune cellule aderenti potrebbero fuoriuscire dall’inserto sul fondo dei pozzetti, aumentando il consumo medio. Controllare al microscopio la dispersione cellulare oltre l’inserto e sostituire l’inserto in una nuova piastra a 6 pozzetti sotto una cappa sterile, se necessario. 5.3D Risultati sperimentali simili al midollo osseo NOTA: Dopo la coltivazione 3D, è possibile ottenere diversi risultati in base agli obiettivi dell’esperimento. Analisi delle proteineNOTA: Nel corso dell’esperimento 3D, le proteine secrete dalle cellule presenti nella struttura simile al midollo osseo possono essere raccolte per ulteriori analisi.Quando il terreno di coltura viene cambiato 2 volte alla settimana, conservare il surnatante recuperato dall’interno dell’inserto a -80 °C per valutare la produzione di proteine di interesse all’interno del sistema. Dissociare le cellule dalla struttura 3D (sotto un cappuccio sterile se le cellule devono essere ordinate)NOTA: Le cellule coltivate nel sistema 3D simile al midollo osseo possono essere recuperate, ordinate e ulteriormente analizzate.Alla fine dell’esperimento, in una provetta da 15 ml, mescolare 4,5 mL di RPMI con 0,5 mL di FBS integrato con 0,4 mg/mL di collagenasi e riscaldare la soluzione a 37 °C per 10 minuti. Posizionare l’inserto capovolto (lato della membrana bianca sulla parte superiore) su una copertura sterile della piastra a 6 pozzetti per tagliare correttamente la membrana. Utilizzare un bisturi sterile per tagliare la membrana dai lati, recuperando così un disco solido bianco. Introdurre il disco all’interno del tubo caldo da 15 mL preparato al punto 5.2.1. Posizionare il tubo in una ruota attiva in un’incubatrice a 37 °C e incubare per 10 minuti per consentire la digestione (a contatto con la collagenasi). Applicare lo stesso tempo di incubazione per tutte le membrane per evitare un’analisi distorta. Dopo 10 minuti, centrifugare il tubo da 15 ml per 5 minuti a 1.575 × g a temperatura ambiente, eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 5 ml di 1x PBS caldo. NOTA: In questa fase, poiché la membrana in policarbonato generalmente galleggia nella frazione surnatante può essere scartata utilizzando una punta di pipetta sterile. Se la membrana è ancora inclusa nel pellet, lasciarla e rimuoverla alla fine del passaggio successivo. Risospendere il pellet in 300 μL di tripsina calda, vorticare il tubo per 10 s e metterlo a bagnomaria a 37 °C per 1 minuto. Interrompere la digestione enzimatica aggiungendo 1 ml di FBS puro caldo. Con una micropipetta da 1 ml, aspirare ed erogare meccanicamente il mezzo per dissociare completamente il disco.ATTENZIONE: La fase di aspirazione/erogazione deve essere molto rapida, altrimenti le perline si sedimenteranno all’interno della punta. Centrifugare il tubo per 5 minuti a 1.575 × g. Risospendere il pellet in 3 ml di 1x PBS integrato con 10% FBS. Lasciare sedimentare le perle per 5 s prima di raccogliere il surnatante e filtrarlo attraverso un filtro cellulare da 35 μm posto su un tubo di raccolta. Centrifugare il filtrato recuperato per 5 minuti a 1.575 × g. Contare le cellule con tripano blu per valutare la vitalità e procedere alle analisi di citometria a flusso.NOTA: Il numero di cellule vitali recuperate dopo l’incubazione del blu di tripano è ~ 1-2 × 105 cellule per inserto digerito. Marcatura con citometria a flusso delle cellule recuperateNOTA: Le cellule recuperate dalla struttura 3D simile al midollo osseo possono essere etichettate e ulteriormente analizzate mediante citometria a flusso. Utilizzare un mix di anticorpi per rilevare i diversi compartimenti dopo la dissociazione 3D. Qui, CD45 (colora le cellule ematologiche di interesse), CD31 (colora il compartimento vascolare) e CD73 (colora il compartimento osteoblastico) sono stati utilizzati a 1 μL in 50 μL di PBS + 2% FBS. Tenere tutte le cellule e gli anticorpi preparati su ghiaccio (4 °C) lontano dalla luce durante l’intero processo.Risospendere i pellet nella miscela anticorpale e incubare per 30-40 minuti sul ghiaccio al riparo dalla luce. Aggiungere 1 mL di PBS + 2% FBS per lavare le celle e centrifugare per 5 minuti a 1.575 × g. Risospendere il pellet recuperato in 200 μL di 1x PBS + 10% FBS integrato con 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, diluito 1:2.000). Analizzare i tubi in un citometro utilizzando i seguenti parametri: FSC 297 PnV; SSC 220 PnV; DAPI 400 PnV; CD45 APC 505 PnV. Utilizzare un grafico FSC-H rispetto a FSC-W per controllare la popolazione di singoletto. Nella frazione di singoletto, utilizzare un grafico DAPI-A rispetto a FSC-A per determinare la popolazione di cellule vitali (DAPI-negativo). Con la popolazione DAPI-negativa precedentemente controllata, utilizzare un grafico APC-A rispetto a FSC-A per determinare la popolazione CD45-positiva. Fissazione della struttura 3D simile al midollo osseoNOTA: La fissazione della struttura 3D BM-like viene generalmente eseguita per l’immunoistochimica o l’immunofluorescenza per visualizzare le cellule in situ e per un’ulteriore colorazione specifica.Per fissare la struttura simile a BM, trasferire l’inserto (passo 4.3) dalla vecchia piastra a una nuova piastra a 6 pozzetti riempita con 1x PBS. Quindi, sostituire delicatamente il mezzo all’interno dell’inserto con 1x PBS.NOTA: Non lavare la struttura formata con PBS; la pressione del liquido può compromettere la struttura 3D. Una volta lavato l’inserto, posizionarlo all’interno di una nuova piastra a 6 pozzetti e riempire sia il pozzetto che l’inserto con paraformaldeide (PFA) appena aperta al 4% (diluita al 16% in 1x PBS). Lasciare che il processo di fissaggio proceda per 4 ore a temperatura ambiente lontano dalla luce. Al termine del processo di fissaggio, lavare l’inserto una volta con 1x PBS e conservarlo a 4 °C al riparo dalla luce. Tagliare la membrana nella parte inferiore dell’inserto come descritto al punto 5.2.2 per recuperare il disco solido. Incubare il disco 4x per 48 h in EDTA (0,5 M, pH 8) per decalcificare la struttura. Incorporare la struttura in paraffina e tagliare sezioni spesse 4 μm. Utilizzando un immunostainer automatico, incubare le sezioni con anticorpi anti-CD45, anti-CD73 e Ki67. Visualizzare la colorazione con una perossidasi di ravanello di cavallo anti-coniglio o topo (HRP) e con 3,3′-diaminobenzidina come substrato cromogenico e controcolorazione con l’ematossilina di Gill.

Representative Results

Utilizzando questo protocollo, è possibile ricapitolare un microambiente BM-umano minimo, in vitro , 3D, da cui possono essere recuperate cellule vitali da tre diversi compartimenti cellulari (Figura 1). Infatti, dopo l’esposizione desiderata, le strutture 3D BM-simili possono essere dissociate e le MSC, le cellule endoteliali e le cellule ematopoietiche possono essere valutate / caratterizzate utilizzando la citometria a flusso (Figura 2A). Finora, i risultati suggeriscono che è possibile mantenere le cellule ematologiche per almeno 6 settimane all’interno del modello 3D, prima di recuperare cellule vitali (Figura 2B). Tuttavia, sono necessarie indagini future per stimare il limite di questo modello 3D. Inoltre, se necessario, è possibile sostituire la linea cellulare HS27A con MSC primaria di midollo osseo normale (NBM) o leucemia mieloide acuta (LMA) in questo modello 3D BM-like (Figura 2C) o sostituire la linea cellulare ematopoietica con HSC primarie (Figura 2D). Inoltre, quando si analizzano le interazioni tra i compartimenti cellulari o la localizzazione di specifici marcatori di interesse, le strutture simili a BM 3D possono essere fissate e ulteriormente elaborate con l’incorporazione di paraffina e l’immunochimica. Ad esempio, l’analisi del contenuto di CD45 (ematologico) o CD73 (MSC) è stata eseguita utilizzando questi modelli 3D (Figura 3). Figura 1: Diagramma schematico della configurazione iniziale del sistema umano 3D BM-like. Dopo 3 settimane di co-coltura, il tessuto solido simile al BM può essere raccolto o seminato con cellule ematopoietiche (come nell’esempio) o altri tipi di cellule. Se necessario, una volta che le cellule sono aderenti, è possibile aggiungere il trattamento e condurre cambiamenti di mezzo due volte a settimana. Alla fine dell’esperimento, le strutture simili al BM possono essere fissate e ulteriormente elaborate per studi di localizzazione o dissociate per valutare il contenuto cellulare. Abbreviazioni: BCP = fosfato di calcio bifasico; BM = midollo osseo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 2: Recupero di cellule vitali da diversi compartimenti dopo la coltura nel modello 3D BM-like. (A) Modello tipico di recupero cellulare da una struttura dissociata simile al BM con il 9,84% di cellule vitali (DAPI-). Grafici rappresentativi di cellule ematopoietiche (66,6% CD45+), MSC/osteoblasti (88,6% cellule CD73+ all’interno della popolazione CD45-) e cellule endoteliali (22,1% cellule CD31+ all’interno della popolazione CD45-) recuperati dopo la dissociazione 3D. (B) Il sistema 3D consente il mantenimento di cellule ematopoietiche vitali (CD45+) fino a 6 settimane dopo la coltura. (C) I sistemi 3D costituiti da MSC primarie da NBM o AML insieme a HMEC-1 (colorato con Kusabira-Orange in questo esempio) possono mantenere HSC (3,88% cellule DAPI CD45 +) in situ (D). Abbreviazioni: BM = midollo osseo; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo; MSC = cellula staminale mesenchimale; NBM = midollo osseo normale; LMA = leucemia mieloide acuta; HSCs = cellule staminali ematopoietiche; FSC = dispersione in avanti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 3: Visualizzazione delle interazioni cellulari e della proliferazione all’interno del modello 3D BM-like. I sistemi sono stati raccolti dopo 3 settimane di co-coltura 3D con HS27A e HMEC-1 e l’aggiunta di cellule ematopoietiche dopo 1 settimana. La tipica colorazione immunoistochimica (visualizzata in marrone) da parte di IHC è stata visualizzata utilizzando una perossidasi di ravanello di cavallo anti-coniglio o topo e visualizzata con 3,3′-diaminobenzidina come substrato cromogenico e controcolorata con l’ematossilina di Gill e mostra la presenza di cellule ematopoietiche con CD45 (pannello di sinistra), cellule stromali con CD73 (pannello centrale) o proliferazione di tutte le cellule con KI67 (pannello di destra). Barre della scala = 50 μm. Abbreviazioni: BM = midollo osseo; IHC = immunoistochimica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussion

Una delle attuali sfide affrontate dagli studi sui problemi fisiologici umani e patologici associati è la mancanza di modelli che imitino accuratamente le complesse funzioni degli organi umani. Nel caso di modelli umani BM 3D, molti modelli utilizzano idrogel e riproducono parzialmente il BM, illustrando la potenza delle condizioni di coltura 3D rispetto alle culture 2D classiche nel garantire, ad esempio, una migliore differenziazione osteoblastica27,28. Tuttavia, nonostante la buona riproducibilità e facilità d’uso, questi sistemi non imitano la struttura e l’architettura BM 3D umana, il che può avere un impatto significativo su ulteriori analisi. I progressi tecnologici hanno permesso agli scienziati di riprodurre meglio l’ambiente di nicchia osteoblastico umano nativo utilizzando un sistema di bioreattore basato sulla perfusione per mantenere alcune proprietà HSC29. Lo sviluppo di dispositivi microfluidici ha portato a nuovi approcci per riprodurre una struttura simile al midollo osseo rilevante, ma finora hanno raggiunto solo caratteristiche limitate del midollo osseo e quindi hanno limitato le applicazioni30,31,32,33.

I progressi nelle scienze dei materiali hanno contribuito allo sviluppo di una vasta gamma di biomateriali naturali o sintetici, che possono essere utilizzati per sviluppare sistemi di coltura ossea 3D pertinenti. Tuttavia, tali sistemi sono talvolta difficili da sviluppare in laboratori biologici standard senza competenze interne in biofisica. Inoltre, nella maggior parte dei casi, questi sistemi raggiungono una limitata capacità di imitare la struttura 3D dell’osso umano, compreso il microambiente BM, e hanno utilizzato grandi quantità di citochine e fattori di crescita, creando un terreno di coltura artificialmente ricco34.

La scelta di indurre la differenziazione osteoblastica piuttosto che la differenziazione adipocitaria si è basata sul fatto che i preosteoblasti e gli osteoblasti sono stati descritti come parte della nicchia endostale35. Questo ha identificato le cellule osteoblastiche come componenti richiesti sia dell’osso che del midollo osseo. Tra i componenti cellulari del midollo osseo, le cellule endoteliali e stromali occupano gran parte del microambiente. Inoltre, questi due tipi cellulari producono componenti strutturali non cellulari della matrice extracellulare e citochine coinvolte nella regolazione dell’omeostasi e del differenziamento, richieste qui per generare una struttura calcificata. Pertanto, questo giustifica l’uso di cellule endoteliali e stromali e la nostra scelta di linee cellulari per consentire un facile accesso e aumentare la riproducibilità tra i laboratori. Con la coltura della linea HMEC-1 più stabile nel tempo, questa linea cellulare è stata mantenuta per lo sviluppo del sistema 3D. Per le cellule stromali, abbiamo confrontato in coltura 2D la capacità di differenziazione degli osteoblasti delle linee cellulari stromali derivate dal midollo osseo normale: HS5 e HS27A. Abbiamo scoperto che la linea HS5 non si differenziava tanto quanto la linea HS27A nel sistema 3D generato con entrambe le linee cellulari. A questo proposito, i tentativi di sostituire le celle HS27A con la linea HS5 hanno portato alla produzione di una struttura meno rigida, suggerendo che HS27A sono più adatti.

Entrambe le linee cellulari HS27A e HMEC-1 sono state coltivate in diverse combinazioni di mezzi, in cui si ottiene la migliore struttura rigida e allineamenti di HMEC-1 lungo le strutture degli osteoblasti in modo che la produzione della matrice extracellulare porti una relativa rigidità alla struttura di base. L’analisi dell’avanzamento del differenziamento a D14 ha mostrato che il differenziamento era più avanzato a D21 (misurazione di BSP, marcatore osteoblastico tardivo), con un rapporto 1:2 per HMEC-1:HS27A e con risultati migliori quando sono stati introdotti 2 × 106 HS27A. Le cellule endoteliali hanno anche un ruolo importante nella regolazione dell’omeostasi e della differenziazione (tra le altre cose attraverso la fornitura di citochine). Il fatto che le cellule HMEC-1 siano mantenute in questo sistema indica che possono almeno svolgere questo ruolo, e questo contribuisce alla legittimità del nostro modello. Per la linea endoteliale HMEC-1, era importante introdurla abbastanza presto in modo che potesse essere correttamente integrata nella struttura e con la speranza che queste cellule potessero formare allineamenti o addirittura tubi all’interno della struttura. I test di co-coltura di HS27A e HMEC-1 sono stati effettuati introducendo quest’ultimo in diverse fasi: D0, D7, D14; Non sono state osservate differenze degne di nota, né nella differenziazione delle cellule stromali né nel mantenimento o nel posizionamento delle cellule endoteliali. Pertanto, queste cellule sono state introdotte all’inizio del processo. Le cellule ematopoietiche sono state introdotte in un momento in cui la differenziazione osteoblastica sarebbe stata abbastanza avanzata da favorire le interazioni cellula-cellula. Questa scelta è stata condizionata anche dal fatto che questa differenziazione osteoblastica è condizionata dall’utilizzo di un mezzo, che secondo i nostri test, non supporta pienamente il mantenimento delle cellule ematopoietiche. Le cellule ematologiche possono essere linee cellulari o cellule ematopoietiche BM CD45 primarie.

Da questo modello 3D, potremmo immaginare di sostituire ogni tipo di cellula con cellule primarie, normali o patologiche, o anche di aggiungere altri tipi di cellule per aumentare le proprietà biomimetiche, come cellule immunitarie, adipociti o fibroblasti26. Infatti, la linea cellulare HS27A è stata sostituita con MSC BM primarie a basso passaggio. Allo stesso modo, le linee cellulari ematologiche sono state sostituite con cellule ematopoietiche BM primarie. Tuttavia, la sostituzione delle cellule HMEC-1 con cellule endoteliali primarie non è stata ancora testata. Attualmente, questo modello potrebbe ancora essere migliorato in termini di rappresentazione vascolare, poiché anche se le cellule endoteliali sono presenti e interagiscono correttamente con altre cellule del microambiente (ad esempio, cellule ematopoietiche), non formano vasi strutturati, precludendo così la perfusione del flusso per imitare i vasi sanguigni funzionali. Nel complesso, ciò potrebbe aumentare progressivamente la complessità e la rappresentatività dell’attuale modello 3D minimo. L’aggiunta di altri tipi di cellule può facilitare gli studi che indagano su altre questioni, come l’importanza dell’infiammazione BM locale o la resistenza all’immunoterapia.

Tuttavia, questo sistema 3D ha bisogno di 3 settimane prima che le cellule di interesse, le cellule ematologiche o le cellule tumorali epiteliali se viene valutato il processo di metastasi, possano essere aggiunte. Le condizioni sterili devono essere mantenute, poiché i cambi di mezzo due volte alla settimana possono talvolta portare a una contaminazione media. Inoltre, poiché alcune cellule possono migrare attraverso i pori dell’inserto e iniziare a disperdersi nel pozzo, portando ad un aumento del consumo di mezzo, si raccomanda un monitoraggio regolare.

Abbiamo descritto qui un’impalcatura 3D che consente la differenziazione osteoblastica e sviluppato un microambiente rilevante, in vitro , 3D, simile al BM umano. Questo sistema consente l’analisi in situ e il recupero finale di cellule vive. Questo sistema fornisce uno strumento nuovo e altamente flessibile, riproducibile e facile da usare, con una vasta gamma di applicazioni per studiare interazioni e meccanismi all’interno del microambiente BM umano.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo P. Battiston-Montagne e A. Jambon della piattaforma di citometria CRCL e N. Gadot e C. Leneve della Research Pathology Platform, Dipartimento di Ricerca e Innovazione Traslazionale, Centre Léon Bérard. Gli autori sono grati a B. Manship per l’edizione inglese. Questo lavoro è stato finanziato da Inserm e FI-LMC a V. M. S., e S. L. K. A. e L. B. sono stati sostenuti da una sovvenzione della Société Française d’Hématologie.

Materials

3,3-Diaminobenzidine (DAB) Liquid Substrate System MERCK SIGMA D7304 IHC staining
5 mL Pipette SARSTEDT 861253001 Medium change
Anti Mouse HRP Thermofisher 62-6520 IHC secondary staining
Anti Rabbit HRP Thermofisher 31460 IHC secondary staining
Ascorbic Acid 250 μM MERCK SIGMA A92902 ODM medium
BCP CaP Biomaterials
LLC-US		 3D Beads
Beta Glycerophosphate 10 mM MERCK SIGMA G9422 ODM medium
CD31-BV711 BD 744078 3D endothelial Cell population labelling
CD34-APC BD 555824 3D immature hematological Cell population labelling
CD38-PE-Cy5 BD 555461 3D progenitor hematological Cell population labelling
CD45 Miltenyibiotec 130-110-637 IHC staining of hematological cells
CD45-APC BD 555485 3D hematological Cell population labelling
CD45-BV500 BD 560777 3D hematological Cell population labelling
CD73 Miltenyibiotec 130-120-066 IHC staining of stromal compartment
CD73-BV605 BD 563199 3D osteoblastic Cell population labelling
Cell Strainer for FACS equipment with 5 mL tube FALCON 352235 Strainer and tube used to collect the cells and eliminate beads
Collagenase MERCK SIGMA C2674-1G 3D enzymatic dissociation
Cytometry filtration tube Thermofisher 10585801 3D retrieved cells filtration
Cytometry tube Thermofisher 10100151 3D retrieved cells labelling 
DAPI (Solution 12) Chemometec 910-3012 3D retrieved viable cells labelling
Dexamethasone Thermofisher A13449 ODM medium
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate 500 mL Thermofisher 31966021 ODM medium
EGF MERCK SIGMA E9644-0.2MG  HMED-1 medium
Eppendorf 1.5 mL tube SARSTEDT 72696 For beads autoclave and supernatant retieve
Falcon 15 mL FALCON 352096 For 3D Dissociation
FBS DUTSCHER S1900-500 To supplement culturing medium and stop trypsin action
Glutamax Thermofisher A1286001 glutamine substitute for HMED-1 medium
Hematoxylin Solution, Gill No. 1 MERCK SIGMA GHS132-1L IHC staining
HMEC-1 ATCC CRL-3243 3D endothelial Cell population 
HS27A ATCC CRL-2496 3D osteoblastic Cell population 
Hydrocortisone MERCK SIGMA H0135-1MG HMED-1 medium
Insert: Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates THERMO SCIENTIFIC NUNC 140627 To harvest cells and form a 3D Bone like structure
KI-67 IHC Thermofisher MA5-14520 IHC staining of proliferative cells
MCDB 131 Medium, no glutamine Thermofisher 10372019 HMED-1 medium
Micropipette (1,000 µL) Eppendorf  4924000088 Medium change
PBS D 1x Thermofisher 14190169 Cells/ Insert wash
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermofisher 15140122 To supplement culturing medium 
PFA (Formaldehyde 16%) EUROMEDEX EM-15710 3D Fixation (dilution with PBS 1X)
RMPI 1640 medium, glutamax supplement Thermofisher 61870044 Cuture medium
Scalpel   FISHER SCIENTIFIC 11768353 3D membrane cutting
Six well plate FALCON 353046 3D culture
TRYPSIN-EDTA SOLUTION (1x) Thermofisher 25300096 3D enzymatic dissociation
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3D ModelBone MarrowResident CellsPhysiological ContextTumoral ContextStandardized SystemHuman Cell LinesPrimary Cell PopulationsBone Marrow-like StructureCell HarvestIn Situ Cell Localization3D Structure DissociationCellular ComponentMolecular StudiesFunctional StudiesBCP BeadsPolycarbonate MembraneCell Culture InsertsHMEC-1 CellsHS27A CellsVascular CompartmentMesenchymal Stromal Cell CompartmentOsteoblast DifferentiationCell Suspension

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Arizkane, K., Geistlich, K., Moindrot, L., Risson, E., Jeanpierre, S., Barral, L., Bobard, A., Menegazzi, G., Voeltzel, T., Maguer-Satta, V., Lefort, S. A Human Bone Marrow 3D Model to Investigate the Dynamics and Interactions Between Resident Cells in Physiological or Tumoral Contexts. J. Vis. Exp. (190), e64736, doi:10.3791/64736 (2022).
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